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组织保护性多肽ARA290活性氧响应性纳米粒的制备及其防治动脉粥样硬化研究

发布时间:2020-06-08 01:13
【摘要】:一、研究背景心脑血管疾病(Cardiovascular disease,CVD)已经严重威胁到人类健康,被认作人类健康的第一杀手。而动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是心脑血管的疾病的首要病因。目前临床上主要使用他汀类降血脂药物治疗AS,阿司匹林也作为抗炎、抑制血小板活化的抗AS药物被应用于AS的一级和二级预防。他汀类降血脂药物和阿司匹林在临床上均发挥了一定疗效,但是不能完全抑制AS的病程,且长期给药的毒副作用也不断涌现。因此寻找新型有效的抗AS药物,建立毒副作用低的长期给药系统对于防治AS进而防治CVD具有重大意义。动脉粥样硬化是由多种因素诱发的慢性炎症疾病。其中血管内膜中的氧化应激诱导的炎症反应是动脉粥样硬化启动的关键。细胞内膜出现氧化应激后,活性氧及其氧化修饰的脂蛋白通过损伤内皮细胞、刺激内皮细胞分泌大量炎症因子和趋化因子来激活血管内膜中的炎症反应。在AS的发展过程中氧化应激也有着至关重要的作用,例如通过一氧化氮损伤内皮细胞功能,通过ROS促进血管内膜分泌炎症因子等都会促进AS病程的发展。所以有效抑制血管内膜中的氧化应激是防治动脉粥样硬化的重要策略。ARA290是由促红细胞生成素(Erythropoietin,EPO)衍生而来的具有11个氨基酸的组织保护性多肽。其已经被证明具有良好的抗炎、抗氧化和促进组织修复的作用,是一个有潜力的抗AS药物。我们将ARA290与具有活性氧(ROS)响应性的ox-bCD载体材料相结合,以纳米沉淀-自主装法合成了具有ROS响应性的纳米粒递送系统,并观察其体内外的抗AS疗效。二、研究方法1.ARA290治疗动脉粥样硬化的体外研究1.1ARA290对炎症条件下巨噬细胞活性氧产生的影响PMA诱导RAW264.7 2 h后,加入不同剂量的ARA290共孵育2 h,用ROS荧光探针(DCFH-DA)行细胞内ROS染色,流式细胞术检测细胞内的活性氧水平,并荧光成像。1.2ARA290对炎症条件下巨噬细胞分泌炎症因子的影响小鼠巨噬细胞用LPS/IFN-γ刺激,加不同剂量的ARA290孵育12或24 h,产生的炎症细胞因子MCP-1、TNF-α、IL-6用ELISA试剂盒检测。1.3 ARA290对氧化诱导巨噬细胞凋亡的影响不同剂量的ARA290与RAW264.7共孵育2 h,加入H_2O_2孵育7 h,胰酶消化收集细胞,荧光探针染色,流式细胞术检测ARA290对H_2O_2诱导巨噬细胞凋亡的保护作用,以及细胞内的NO水平。1.4 ARA290对MCP-1诱导的巨噬细胞迁移的影响用Transwell法检测不同浓度的ARA290对RAW264.7在MCP-1诱导下的迁移能力的影响。1.5 ARA290对巨噬细胞形成泡沫细胞的影响RAW264.7与(500 ng/mL)LPS共孵育4 h,加入不同剂量的ARA290和50μg/mLox-LDL孵育36 h,4%多聚甲醛固定,油红染色拍照。1.6高剂量ARA290对小鼠巨噬细胞的安全性评价不同剂量的ARA290与RAW264.7共孵育24 h后,用CCK-8试剂盒检测细胞存活率。2.ARA290的体内抗AS性能评价9周龄ApoE~(-/-)小鼠高脂饮食4周,分3组,control组、ARA290高剂量组、ARA290低剂量组,每天腹腔给药,共10周,最后一次给药一天后处死,摘眼球取血测血常规和血生化指标,主动脉油红染色后测斑块面积。3.ARA290纳米递送系统的构建3.1材料的合成与表征对羟甲基本硼酸频那醇酯(PBAP)用N,N'-羰基二咪唑(CDI)活化以后,与β-CD、4-二甲基氨基吡啶(DMAP)溶于无水DMSO中,25℃搅拌24 h,去离子水沉淀,水洗3次冻干后得到白色粉末状产物,用傅里叶红外光谱仪和核磁共振仪检测其化学结构3.2 ARA290活性氧响应性纳米粒的制备通过纳米沉淀法制备ARA290载药纳米粒,卵凝脂无水乙醇溶液与磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG2000)去离子水溶液、去离子水65℃搅拌1 h充分混合形成水相。ARA290或FITC-ARA290溶于不同的有机溶液中,再与溶解有ox-bCD的甲醇溶液混溶形成油相。在0℃条件下将油相滴入水相,搅拌2 h,高速离心,去离子水洗3次后冻干,得到ARA290/ox-bCD、FITC-ARA290/ox-bCD纳米粒。纳米粒用去离子水重分散,马尔文动态光散射粒径仪测粒径,用甲醇溶解,荧光分光光度法测载药量和包封率。在铜网和云母片上滴上纳米粒去离子水混悬液,分别用于透射电镜(TEM)和扫描电镜(SEM)拍照。3.3 ARA290载药纳米粒的体外水解与释放研究称取适量FITC-ARA290/ox-bCD纳米粒混悬于不同H_2O_2浓度的PBS溶液中,放置于37℃孵箱中,定时高速离心后取出部分上清,重分散后加入等量新鲜溶液,再放置于37℃孵箱中,取出的上清避光保存,用荧光分光光度计测定药物的释放量,并绘制药物累计释放曲线。4.ARA290载药纳米粒的体内抗AS性能评价4.1ARA290载药纳米粒体内抗AS性能评价9周龄ApoE-/-小鼠高脂喂养4周,分4组,model组、ARA290组、空白NPs组、载药纳米粒ARA290NPs组,腹腔给药10周,最后一次给药一天后处死,摘眼球取血测血常规和血生化指标,主动脉油红染色后测斑块面积。4.2ARA290载药纳米粒的初步安全性评价取8周龄balb/c小鼠,分别尾静脉注射不同浓度的ARA290/NPs和0.1 mL PBS无菌溶液。正常喂养1周后,摘眼球取血,处死,测血生化和血常规以及脏器指数。三、研究结果1.ARA290能有效抑制小鼠巨噬细胞的炎症反应和活性氧的产生通过流式和ELISA试剂盒检测发现,ARA290能够有效抑制RAW264.7分泌炎症相关细胞因子,如白细胞介素-1β(IL-6)、单核巨噬细胞趋化蛋白-1(MCP-1)以及肿瘤坏死因子-α(TNF-α),以及抑制炎症巨噬细胞中ROS的产生。2.ARA290能够抑制炎症条件下小鼠巨噬细胞凋亡通过细胞流式检测发现,ARA290可以有效抑制炎症条件下小鼠巨噬细胞的凋亡。3.ARA290能有效抑制小鼠巨噬细胞的迁移和泡沫细胞的形成通过细胞染色拍照发现,ARA290能有效抑制由单核巨噬细胞趋化蛋白-1(MCP-1)诱导的巨噬细胞的迁移,以及对ox-LDL的摄取,抑制巨噬细胞来源泡沫细胞的形成。4.ARA290能有效抑制小鼠主动脉中的斑块面积在ApoE~(-/-)小鼠模型的长期给药中,低剂量的ARA290能有效抑制斑块的增长,且没有明显的毒副作用。5.ARA290在小鼠巨噬细胞中,具有很高的安全性即使极高剂量的ARA290(1000μg/mL)与RAW264.7共孵育24 h,也不会诱导RAW264.7产生明显的凋亡。6.成功合成了载体材料并对其结构进行了表征以β-CD为原料,合成PBAP修饰的ox-bCD通过红外和核磁共振检测发现,一个β-CD上结合了5个PBAP单元。7.成功构建ARA290的活性氧响应性纳米递送系统并对其进行了表征ox-bCD不溶于水易溶于甲醇,ARA290易溶于水和酸性有机溶剂,不断更改ARA290的溶剂,使其能与ox-bCD的甲醇溶液混溶形成油相,逐滴滴入水相,以纳米沉淀-自组装法合成了载药量较高的ARA290/ox-bCD/NPs。8.ARA290活性氧响应性纳米粒能够减轻主动脉斑块的面积在ApoE~(-/-)小鼠的长期给药模型中,与ARA290组和空白纳米粒组相比,ARA290/NPs组拥有最好的疗效,能够有效降低主动脉中的斑块面积四、研究结论1.体内外实验均表明ARA290具有抗动脉粥样硬化的作用。2.成功构建了基于ox-bCD的ARA290纳米递送系统。3.体内实验表明ARA290活性氧响应性纳米粒具有抗动脉粥样硬化作用,且有效提高了ARA290的药效。
【图文】:

巨噬细胞,因子


A 图 7.巨噬细胞内 ROS 水平。A:免疫荧光图(标0.05, ***P2.1.3 讨 论在 RAW264.7 细胞中,ARA290 抑制具有一定的剂量依赖性。1 μg/mL 和 10 μg生,且给药 12 h 和 24 h 之间没有显著性差症因子 TNF-α、IL-6、MCP-1 的产生,且剂药 12 h 和 24 h 之间差异显著,其余没有还是在 THP-1 细胞中,中高剂量的 ARA29化因子。在 PMA 的诱导下,巨噬细胞内能产生

流式,凋亡,经典,离心管


除 Control 外每孔加入 200 μM H2O2,37℃、5%CO2条件下细胞养 12 h。收集培养基于 4 mL 离心管中,预冷的 PBS 小心冲洗孔板内细胞一有 EDTA 的胰酶消化,完全培养基终止反应,收集于原来的 4 mL 离心管中离心 5 min,弃去上清。2) 0.5 mL Staining Buffer 重悬细胞,转移到 1.5 mL 的离心管中,1000 rpm 弃去上清。加入 100 μLAnnexin V Binding Buffer 重悬细胞。3) 加入 5 μL FITC 溶液,10 μL PI 溶液,,轻微震荡,常温下避光孵育 15 min4) 加入 200 μLAnnexin V binding buffer,震荡均匀,AccuriC6 流式细胞仪检2 实验结果如图8-9所示,RAW264.7在受到H2O2损伤后,出现大量凋亡,极低剂量的 ARng/mL)不能抑制 RAW264.7 细胞凋亡,低剂量和高剂量的 ARA290 能有效凋亡,且两者之间没有显著差异。
【学位授予单位】:中国人民解放军陆军军医大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:R943;R96

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本文编号:2702290


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