纳米HA-PNS-LIP靶向CD44对兔BMSCs成骨分化的研究

发布时间：2020-06-09 08:44

【摘要】：目的:构建透明质酸修饰的三七总皂苷靶向脂质体(HA-PNS-LIP)及三七总皂苷脂质体(PNS-LIP)的纳米载药递送体系,对其基本性质进行表征及稳定性检测。HA-PNS-LIP靶向兔BMSCs表面CD44受体,通过检测其钙结节形成能力、成骨相关细胞因子TGF-β1、ALP及OCN的表达,初步探讨靶向BMSCs递送PNS对其成骨能力的影响。方法:1.构建HA-PNS-LIP及PNS-LIP载药纳米粒子,HPLC法测定药物浓度及包封率、载药量,粒径分析仪检测粒径、PDI及Zeta电位,透射电子显微镜检测形态,同时进行稳定性检测;2.体外分离、培养及鉴定兔BMSCs;3.设立空白对照组(无干预措施的BMSCs)、PNS组(100mg/L PNS培养液的BMSCs)、HA-PNS-LIP组和PNS-LIP组(3个浓度:5、10、20μg/ml培养液的BMSCs);倒置荧光显微镜观察BMSCs对各浓度HA-PNS-LIP、PNS-LIP的摄取效率;4.CCK-8法检测载药纳米粒子对BMSCs的细胞毒性影响;5.第21天茜素红染色法检测各组钙结节形成情况;6.药物作用后第3、6、12天,用Real-time qPCR检测TGF-β1、ALP及OCN的mRNA表达变化;7.药物作用后第3、6、12天,用Western blot检测TGF-β1、ALP及OCN的蛋白表达变化。8.载药纳米粒子作用第12天,用免疫荧光检测TGF-β1、ALP及OCN的蛋白表达。结果:1.纳米载药颗粒药物浓度为923μg/ml;包封率:HA-PNS-LIP:86.65±0.45%,PNS-LIP:85.20±0.90%;载药量:HA-PNS-LIP:7.89±0.04%,PNS-LIP:7.75±0.08%;粒径:HA-PNS-LIP为72.84±0.14nm,PNS-LIP为69.33±1.39nm;PDI:HA-PNS-LIP为0.221±0.015,PNS-LIP为0.237±0.011;Zeta电位:HA-PNS-LIP为-18.55±0.07mV,PNS-LIP为-14.70±0.14mV;透射电子显微镜:两种载药纳米粒子为类圆形双层囊泡结构;稳定性:随着放置时间的延长,脂质体溶液中药物含量明显下降。2.细胞摄取实验结果:10、20μg/ml HA-PNS-LIP组细胞摄取效率≥50%;3.细胞毒性结果:10μg/ml HA-PNS-LIP组、PNS-LLP组对BMSCs细胞毒性最小。4.茜素红染色结果:10μg/ml HA-PNS-LLP组钙结节形成较其他3组明显增强,P0.05。5.Real-time qPCR和Western blot结果:从mRNA及蛋白层次看:(1)TGF-β1的表达变化:10μg/ml HA-PNS-LLP组的表达量在各时间点都高于其他实验组,差异存在统计学意义,P0.05;10μg/ml PNS-LLP组介于10μg/ml HA-PNS-LLP组与100mg/L PNS组之间;各实验组的表达量都随着时间的延长而增加。(2)ALP的表达变化:各实验组在6天时出现显著高表达P0.01,12天时持续高表达P0.05;10μg/ml HA-PNS-LLP组的表达量在各时间点都高于其他实验组,差异存在统计学意义,P0.05;10μg/ml PNS-LLP组介于10μg/ml HA-PNS-LLP组与100mg/L PNS组之间。(3)OCN的表达变化:各实验组在12天时出现显著高表达P0.01;10μg/ml HA-PNS-LLP组的表达量在各时间点都高于其他实验组,差异存在统计学意义,P0.05;10μg/ml PNS-LLP组介于10μg/ml HA-PNS-LLP组与100mg/L PNS组之间。6.免疫荧光结果显示:在12天,10μg/ml HA-PNS-LLP组的TGF-β1、ALP及OCN的蛋白表达较10μg/ml HA-PNS-LLP组为强阳性。结论:1.构建的HA-PNS-LIP、PNS-LIP载药纳米粒子具有良好的表征,2周内具有较好的稳定性;2.10μg/ml HA-PNS-LIP靶向兔BMSCs递送PNS可明显增强钙结节形成能力,可明显促TGF-β1、ALP及OCN mRNA及蛋白的表达,促成骨分化。
【图文】：

NHS）溶解完全，37 °C 下反应 24 h。然后边搅拌边醇胺（Dioleoyl Phosphoethanolamine，DOPE）（48 下反应过夜，转移至透析袋中（截留分子量 8000 14纯化，收集溶液，冷冻干燥即得 HA-DOPE 产物。饰 PNS 脂质体的制备NS、0.5mg 异硫氰酸荧光素（Fluoresceinisothiocyan卵磷脂溶于适量无水乙醇和氯仿的混合溶剂中，60剂，然后加入预热的 HA-DOPE（1mg）水溶液水化细胞破碎仪超声 1min 后，即得脂质体溶液。随后将袋（截留分子量 8000-14000KDa），于纯水中透析纯膜过滤得到 1mg/ml 淡黄色载药脂质体溶液。

液相色谱法（HighPerformanceLiquidChromatogr的药物含量。的标准曲线制备 5mgPNS，采用甲醇溶解并稀释至 50、100、20系列浓度，，甲醇溶液作为空白对照。Agilent 11：DiamonsilC18(2)5μ250×4.6mm，流动相：乙腈in，柱温：30 °C，检测波长：203 nm 下检测。横为 PNS 色谱峰面积，建立线性回归曲线。质体载药含量测定药脂质体溶液，采用甲醇溶解定容至标曲浓度
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R965

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本文编号：2704435