Ad-siDHCR24降胆固醇作用的初步药效学研究

发布时间：2020-06-10 02:01

【摘要】：高血脂症是指高胆固醇、高甘油三酯、极低密度脂蛋白增高和高密度脂蛋白降低的脂蛋白代谢异常性疾病。多项临床调查证明,高血脂是导致动脉粥样硬化症以及冠心病等心脑血管疾病的危险因素。因此,降血脂药物的使用,被认为是防治心脑血管疾病的重要且有效的途径。尽管目前临床上存在多种类型的降血脂药物,但因为药物的毒副作用以及患者的个体差异,使心脑血管病的发病率仍然居高不下,因此开发新型降胆固醇药物仍然是研发新药领域的重点。人体内胆固醇的来源有两种方式,外源性摄入胆固醇和内源性生物合成的胆固醇,其中内源性合成途径为主要方式,因此通过靶向胆固醇的内源性合成途径能够有效的控制胆固醇水平。DHCR24是胆固醇合成途径中最后一步的催化酶,负责将胆甾醇还原为胆固醇。DHCR24基因敲除小鼠来源的胚胎纤维细胞的胆固醇浓度显著降低,暗示DHCR24可以作为降胆固醇药物新靶点从而发挥其下调胆固醇的作用。为了探究以DHCR24为靶点开发新型降胆固醇药物的可能性,我们利用实验室已经构建好的四种靶向DHCR24基因的重组腺病毒干扰载体Ad-siDHCR24,研究其干扰靶基因DHCR24表达的效率,并探讨其在细胞和动物水平降低胆固醇的效果。为了检验四种针对不同干扰靶点的Ad-siDHCR24干扰DHCR24基因表达的效率,我们将其分别感染或四种等比例混合(Mix)后感染至人肝脏细胞株HepG2细胞。实时定量荧光PCR结果显示No.1、No.3、No.4和Mix组的Ad-siDHCR24能够显著下调DHCR24 mRNA的表达水平,Western Blotting实验也表明Mix组Ad-siDHCR24能够高效的干扰DHCR24蛋白水平的表达。这些结果证明实验室前期构建的Ad-siDHCR24以等比例混合使用能够减少siRNA对于靶基因的脱靶作用,更显著降低DHCR24的mRNA和蛋白水平的表达水平,有效发挥沉默DHCR24基因表达的作用。为了进一步探究重组腺病毒Ad-siDHCR24在细胞水平的降胆固醇效果,我们将感染重组腺病毒混合液(Ad-siDHCR24 Mix)的HepG2细胞进行了胆固醇荧光染色剂非律平的细胞染色。结果显示,与对照组相比,感染了Ad-siDHCR24 Mix细胞的蓝色荧光强度显著减弱,暗示Ad-siDHCR24 Mix重组腺病毒能够通过显著降低细胞内胆固醇的水平。进一步利用利用高效液相色谱法检测细胞内胆固醇和其前体胆甾醇的水平。实验结果表明,感染Ad-siDHCR24 Mix组细胞的胆固醇水平与对照组相比显著降低,这与细胞胆固醇荧光染色法结果一致。这些结果证明Ad-siDHCR24 Mix通过沉默靶基因DHCR24的表达而发挥了降低胆固醇生物合成的作用。最后,我们研究了Ad-siDHCR24 Mix在动物水平对胆固醇含量的影响。我们使用高脂饲料饲养C57BL/6J小鼠,成功建立高血脂模型,通过尾静脉注射AdsiDHCR24 Mix腺病毒(药物组),进行肝脏组织的HE染色分析以及血液生化指标分析,用以确定降胆固醇效果。HE染色结果表明,与高血脂模型组的对照组相比,Ad-siDHCR24 Mix的小鼠肝脏组织细胞变小,所含脂质变少,空泡化水平显著降低。同时血液生化指标检测的结果表明药物组小鼠血清中胆固醇、甘油三脂以及低密度脂蛋白固醇水平均呈现出显著性下降,并伴随着高密度脂蛋白固醇的升高。以上结果证明,Ad-siDHCR24 Mix可以在动物水平成功实现降血脂效果。综上所述,本研究通过对重组腺病毒干扰载体Ad-siDHCR24降胆固醇效果的初步药效学研究,证明了Ad-siDHCR24 Mix能够通过干扰DHCR24的表达,实现降低血脂的效果。本研究证明DHCR24可以作为降血脂药物的新靶点,从而为开发新型抗心血管疾病药物提供了新的思路和理论依据。
【图文】：

胆固醇

图 0-2 胆固醇的流出图(Frederick R,et al. [J] Nature, 2005)物已经进化出复杂而精确的机制以保持细胞内胆固醇维持在内胆固醇稳态遭到破坏时后果是非常严重的，会导致疾病化，因此胆固醇稳态对于维持人体健康来说非常重要6。

胆固醇合成,细胞内,胆固醇酰基转移酶,胆汁盐

0-1 细胞内源性胆固醇合成（EserJ.Zerenturk,etal.[J]progressinLipidResear此外，细胞还可以通过控制胆固醇流出的方式来调控。多重跨膜蛋白P-binding cassette transporter A1, ABCA1）促进细胞中磷脂向脂质缺白 A-I（ApolipoproteinA-I, ApoA-I）转移，，通过胆固醇酰基转移酶-I 颗粒转化为血液中的高密度脂蛋白(High density lipoprotein, HD 与肝细胞中的清道夫受体 B1（scavengerreceptor-B1,SR-B1）结合，胆固醇酯转移至肝脏，从而转化为胆汁盐排出体外[10]。
【学位授予单位】：辽宁大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R96

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