新型化合物NT-89的抗真菌活性与作用机制研究

发布时间：2020-06-14 00:36

【摘要】：侵袭性真菌感染已成为人类健康的严重威胁,其主要治疗手段为药物治疗。临床常用抗真菌药物包括氮唑类、多烯类、棘白菌素类等,但耐药性增加、严重的毒副作用、半衰期短等缺陷正在逐渐限制现有药物的临床使用,而近年来多重耐药真菌的出现,更使得抗真菌新药研发与新靶点研究的需求变得更加迫切。细胞壁作为真菌区别于哺乳动物的特有细胞结构,在真菌的各项生命活动中都发挥着重要作用。真菌细胞壁由内层的以葡聚糖骨架为主的多聚糖层以及外层的糖蛋白层构成,细胞壁蛋白质大部分通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)残基被锚定在细胞壁内层上,称为细胞壁GPI锚定蛋白(GPI-CWP),这些蛋白在真菌的生命活动中发挥了重要作用,因此通过抑制GPI锚的合成破坏真菌细胞壁成为了抗真菌药物与靶点研究的一大热点。本课题组前期在现有的以GPI合成通路中肌醇酰基转移酶Gwt1蛋白为靶点的10b、E1210、G884等GPI合成抑制剂的结构基础上,设计合成了具有较好抗真菌活性的氨基吡啶类化合物NT-89(曾用名GPI-89),并验证了其对于白念珠菌细胞壁结构的破坏作用。本课题将在前期研究的基础上进一步研究NT-89的体内外抗真菌活性与作用机制,为新药研发提供参考。我们首先通过测定最低抑菌浓度(MIC),考察了41株白念珠菌以及多种其他真菌对NT-89的药物敏感性,并与氮唑类药物进行比较,同时考察了NT-89与氮唑类药物的相互作用关系。结果显示NT-89能够有效抑制白念珠菌生长且不受氟康唑耐药性影响,MIC_(80)范围为0.0625-0.5μg/mL,对其他真菌也表现出良好抑菌活性,但对皮肤癣菌无抑制作用。NT-89与氟康唑等氮唑类药物合用在体外主要表现为协同或相加作用。在对NT-89对白念珠菌毒力因子抑制作用的考察中,我们发现低浓度的NT-89即能够显著抑制白念珠菌的黏附、菌丝以及生物被膜的形成。利用白念珠菌系统性感染小鼠模型,我们考察了NT-89单独使用以及与氟康唑合用的体内活性,结果显示一定治疗浓度下的NT-89能够延长白念珠菌感染小鼠的生存时间,与低浓度氟康唑合用在体内表现出协同作用,不同给药途径的疗效存在差异。接下来我们通过构建白念珠菌GWT1单基因缺失(GWT1/gwt1Δ)菌株验证NT-89的作用靶点,结果显示GWT1/gwt1Δ菌株对NT-89的敏感性高于亲本菌SN152,菌丝生长更易受到NT-89的抑制,提示GWT1表达产物可能是NT-89的作用靶点。通过利用GC-MS对白念珠菌甾醇组成的分析以及RT-qPCR对甾醇合成通路中关键酶的基因表达水平的检测,我们发现NT-89还影响了白念珠菌麦角甾醇的合成通路,通路中的关键酶被直接或间接抑制,使得甾醇合成的中间产物增加,麦角甾醇合成减少,这一机制有助于NT-89发挥抗真菌作用,并有可能是NT-89与氮唑类药物产生协同作用的原因。最后我们利用定量蛋白质组学技术iTRAQ检测并分析了NT-89处理后白念珠菌蛋白质组的含量变化。结果显示,在NT-89处理后可见GPI锚定蛋白含量减少,其中Ywp1p、Pga10p等与真菌侵袭和毒力相关的蛋白含量减少最显著,此外部分与细胞壁修复有关的GPI锚定蛋白含量增加,提示在细胞壁表面糖蛋白缺失引起细胞壁结构被破坏后,白念珠菌细胞通过反馈调节增强了对细胞壁的修复,而蛋白质合成有关蛋白表达的增加也表明细胞增强了蛋白质的合成以加强对细胞壁的修复。综上所述,NT-89是一种具有良好体内外抗真菌活性的新型抗真菌化合物,并能够抑制真菌的黏附与菌丝等毒力因子,它能通过抑制GPI锚合成通路中的Gwt1蛋白,减少细胞壁GPI锚定蛋白的含量并抑制真菌生长,此外NT-89还能够影响白念珠菌的麦角甾醇合成通路。有关NT-89抗真菌作用的具体机制还有待于更进一步的研究。 【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R96

【图文】：

隐球菌,念珠菌,亲和力,甲真菌病

海军军医大学硕士学位论文- 74 -发了对真菌具有更高选择性的VT-1161与VT-1129等四氮唑类药物（见图1 a、b）[14]。1.1 VT-1161VT-1161 对真菌的 CYP51 具有比其他氮唑类药物更高的选择性，对白念珠菌CYP51 的亲和力（Kd≤39 nM）超过了对人体中同源酶体的 2 000 倍以上[15]。它能够有效抑制 CYP51 活性（半抑制浓度 IC50范围 1.4~1.6 μM），使白念珠菌中麦角甾醇含量降低95%[15]。VT-1161体外抑制白念珠菌的最低抑菌浓度（MIC）为0.002 μg/mL，对耐氟康唑菌株的 MIC90为 0.12 μg/mL[15-16]；还可有效作用于小鼠的球孢子菌病（球孢子菌体外 MIC90为 2 μg/mL）、皮肤癣菌引起的浅部真菌感染以及根霉菌感染引起的毛霉菌病等感染模型[17-20]。小鼠体内药动学实验显示，，VT-1161 具有分布体积广（1.4L/kg）、口服生物利用度高（73%）、半衰期长（＞48 h）等特点[16]。VT-1161 目前已经完成了治疗（趾）甲真菌病和复发性阴道念珠菌病的 IIb 期临床试验[16]。1.2 VT-1129VT-1129 具有与 VT-1161 相同的基本骨架，主要表现出对隐球菌，如新生隐球菌（MIC90为 0.060 μg/mL）和格特隐球菌（MIC90为 0.25 μg/mL）等的抑制活性[21]，对耐氟康唑的新生隐球菌具有一定的抑制作用（MIC50为 0.25 μg/mL ，MIC90为 2 μg/mL）[22]。VT-1129对隐球菌的CYP51具有强亲和力及选择性抑制作用（Kd值为14~25 nM

葡聚糖合成酶,抑制剂a,菌素

2.2 SCY-078SCY-078（原名MK-3118，Scynexis Inc.，见图2 b）是天然化合物Enfumafungin[38-39]（提取自植物内生真菌 Hormonema sp.）的半合成衍生物，具有不同于棘白菌素的三萜烯结构[38]，是一种新型的口服 β-1,3-葡聚糖合成酶抑制剂[40]。SCY-078 在体内外均能发挥对念珠菌的抑制作用[41,42]，对念珠菌或曲霉菌的抑制活性略低于棘白菌素

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