姜黄素光动力疗法对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌及其生物膜作用的体外研究

发布时间：2020-06-13 23:46

【摘要】：目的:探讨姜黄素介导的光动力疗法(photodynamic therapy,PDT)体外对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)及其生物膜活性的影响。方法:1.姜黄素溶于0.5%二甲基亚砜(Dimethyl Sulphoxide,DMSO)配置成不同浓度(1,6.25,12.5,25μM)的溶液,单纯DMSO作为对照。利用单态氧荧光探针(Singlet Oxygen Sensor Green reagent,SOSG)验证PDT作用下姜黄素产生活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)的情况。2.实验对象为MRSA悬液和MRSA生物膜,均分为四组。MRSA悬液组和MRSA生物膜组的姜黄素浓度梯度皆为1、6.25、12.5、25μM。分组处理:(1)单纯姜黄素组:分别加入各浓度姜黄素后,37℃孵育30 min,不给予照射。(2)单纯PDT组:仅给予450 nm波长光源照射(辐照度1 W/cm2,照射时间5 min)。(3)姜黄素-PDT组:分别加入各浓度姜黄素后,37℃孵育30 min,然后450 nm波长光源照射(辐照度1 W/cm2,照射时间5 min)。(4)空白对照组:不给予姜黄素,不给予照射。处理后稀释平板法检测MRSA浮游菌存活率,MTT法测定生物膜内MRSA存活率。MRSA生物膜通过结晶紫染色后光学显微镜下进行鉴定与观察结构改变。3.实验对象为小鼠成骨细胞,分组及处理同细菌实验,但姜黄素只用最高浓度25μM。分组处理后,应用细胞形态观察及MTT法两种方式检测姜黄素介导PDT的细胞毒性。结果:1.SOSG检测结果显示,姜黄素在PDT作用下产生ROS呈浓度依赖性;当姜黄素浓度一定时,产生ROS量随时间增长,5 min后趋于稳定。2.实验浓度范围内,姜黄素-PDT组对MRSA浮游菌及生物膜内MRSA的均有显著杀伤作用,且呈姜黄素浓度依赖性。姜黄素浓度为1μM时,MRSA浮游菌存活率为(95.62±1.24)%(P0.05),生物膜内MRSA的存活率为(96.60±0.89)%(P0.05),差异有统计学意义但杀伤抑制作用微弱;浓度为25μM时,MRSA浮游菌存活率降至(0.38±0.32)%(P0.05),达到99%以上的杀伤,生物膜内MRSA的存活率为(34.50±1.44)%(P0.05)。同时,结晶紫染色后光镜下观察结果显示,25μM姜黄素介导PDT可使生物膜结构散乱、完整性破坏明显。单纯姜黄素组、单纯PDT组与空白对照组相比结果无统计学意义。3.细胞形态观察结果显示:分组处理后,各组成骨细胞生长良好,呈长梭形或不规则形状,与空白对照组相比,细胞形态、密度无显著差别;MTT实验显示:4组结果均属RGR分级“0”或“1”级,未检测到姜黄素介导PDT的细胞毒性。结论:姜黄素介导PDT在体外对MRSA浮游菌及生物膜内MRSA皆有良好的杀伤作用,但MRSA浮游菌较生物膜内细菌对姜黄素光动力处理更加敏感。姜黄素介导PDT可有效破坏MRSA生物膜结构。细胞毒性实验未检测到姜黄素对成骨细胞的细胞毒性。姜黄素介导PDT为MRSA型PJI的治疗提供一个新的药物选择与视角。 【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R96

【图文】：

姜黄素,荧光强度,浓度依赖性,统计学意义

SG 结果显示，不同浓度姜黄素（6.25、12.5、25 μM）在 PDT 作用 1 mi度值与 DMSO 相比均有统计学意义（P＜0.05）。而且姜黄素浓度越高，越强，由此可见，姜黄素产生 ROS 呈浓度依赖性（如图 1）。

姜黄素,浮游菌,荧光强度,杀伤作用

图 2. 25 μM 姜黄素处理后荧光强度值与时间的关系黄素介导 PDT 对 MRSA 浮游菌的杀伤通过稀释平板法（如图 3），显示单纯 PDT 组、不同剂量姜黄素组和空白对照RSA 浮游菌存活率均无明显差异（P＞0.05）。姜黄素-PDT 组的 MRSA 存活于空白对照组、PDT 组和姜黄素组，，差异有统计学意义（P＜0.05）。如表 1姜黄素浓度为 1 μM 时，MRSA 浮游菌存活率为（95.62±1.24）%（P＜0.05）RSA 浮游菌杀伤作用微弱；姜黄素浓度升至 12.5 μM 时，MRSA 浮游菌存活43.42±1.71）%（P＜0.01），杀伤作用明显增强；姜黄素浓度至 25 μM 时，仅为（0.38±0.32）%（P＜0.01），对 MRSA 浮游菌的杀伤作用达 99%以上。见，姜黄素介导 PDT 对 MRSA 浮游菌有浓度依赖性的杀伤抑制作用。

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