低氧介导的肾细胞癌中有机阳离子转运体OCT2表达下调和地西他滨抵抗的机制研究

发布时间：2020-06-14 02:31

【摘要】：肾细胞癌(Renal cell canceI.,RCC)是泌尿生殖系肿瘤中死亡率最高的癌症,其发病率约占成人恶性肿瘤的3.8%,致死率约占2.5%。RCC对放疗不敏感,各类化疗方案对转移性肾癌的治疗有效率仅为1 0%-15%。有机阳离子转运体OCT2(Organic cation transporter,member 2,SLC22A2)是肾脏中表达最高的摄取型药物转运体,启动子区域异常高甲基化是其在肾癌中沉默的主要原因,导致了肾癌细胞对奥沙利铂等铂类化疗药物的耐药。我们实验室前期研究发现,将DNA甲基转移酶抑制剂地西他滨(Decitabine,DAC)与奥沙利铂联用,可逆转肾癌细胞中OCT2的低表达,增敏奥沙利铂的抗癌作用。但影像学结果显示在临床治疗过程中,该给药方案虽然可以抑制肿瘤继续生长,但肿瘤未见明显缩小。有研究表明高达50%-60%的实体瘤晚期表现出局部缺氧,RCC作为一种实体瘤,随着癌细胞的不断增殖同样表现出低氧的肿瘤微环境。基于上述临床现象,考虑到RCC的低氧特征,本课题在前期研究的基础上,探究低氧对于DAC去甲基化功能的影响。我们通过在常氧(20%氧浓度)和低氧(1%氧浓度)下对肾癌细胞进行DAC处理后,检测OCT2 mRNA和蛋白表达水平以及启动子区甲基化和组蛋白H3K4me3修饰的变化,发现低氧下DAC无法诱导OCT2的表达,DAC处理后OCT2启动子区依旧处于高甲基化、低H3K4me3修饰的转录抑制状态。接下来,我们通过检测DNA甲基化动态修饰过程以及DAC代谢通路中关键因子在低氧下的表达变化,进一步探究低氧介导的RCC细胞DAC抵抗的具体机制。我们发现低氧主要通过下调平衡型核苷转运体(Equilibrative nucleoside transporter 1,ENT1)的表达,抑制RCC细胞对DAC的摄取。另外,通过qPCR、western blot和免疫组化技术对RCC肿瘤组织和配对正常组织中ENT 1表达检测的结果表明,ENT1的表达在肾癌组织中也异常下调。随后,我们又探究了低氧下ENT1表达下调的生物学机制,发现低氧可以通过低氧诱导因子(HIF-lα)以及蛋白酶体和溶酶体通路在转录和转录后水平参与ENT1的表达调控。由于低氧可以通过影响表观遗传修饰间接参与基因表达调控。我们同时考察了低氧介导的组蛋白乙酰化修饰水平和miRNA表达变化对于OCT2的表达调控作用。我们发现,低氧下肾癌细胞中组蛋白去乙酰化酶HDAC9表达异常上调,导致OCT2启动子区域H3K27ac修饰水平下调,从而在转录水平抑制OCT2表达。另外,肾癌中异常上调的miR-489-3p可以通过靶向OCT2 3'-UTR抑制其表达,增加肾癌细胞对于奥沙利铂的化疗抵抗。低氧下,miR-489-3p的前体和初始转录本表达均上调。综上所述,本研究阐明了低氧阻碍DAC入胞的机制,从多个角度探究了低氧对OCT2表达调控的作用,并提出miR-489-3p作为潜在肾癌初期诊断标志物的可行性,对优化肾癌现有的临床治疗方案具有重要意义。 【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R96

【图文】：

川椒,低氧

浙江大学博士学位论文逦低氧下，ＥＮＴ１介导的肾细胞癌ＤＡＣ抵抗逡逑复氧气浓度，是否可以逆转低氧下肾癌细胞对于ＤＡＣ的抵抗呢？我们将肾癌细胞逡逑在低氧下培养１邋ｄ邋（Ｈ１）或２邋ｄ邋（Ｈ２）后，再转移至常氧环境，进行３邋ｄ邋（Ｎ３）的逡逑ＤＡＣ处理，然后通过ｑＲＴ－ＰＣＲ检测０ＣＴ２的表达情况，发现低氧下ＤＡＣ无法诱导逡逑０ＣＴ２的表达，但如果低氧放置数天后对其恢复供氧，ＤＡＣ又可以重新诱导０ＣＴ２逡逑的表达（Ｆｉｇ．３．２７Ａ）。低氧下放置一天后表达下调的ＥＮＴ１也可以通过恢复供氧的逡逑方式重新表达，并随着常氧暴露的时间加长而逐渐恢复至正常表达水平（Ｆｉｇ．３．２７逡逑Ｂ）。另外，低氧放置的时间越久，恢复供氧对于其去甲基化作用的逆转效果就越逡逑弱（Ｆｉｇ．３．２７邋Ａ），这提示我们需要进行更长时间的常氧暴露以使细胞重新适应常氧逡逑环境，，恢复对ＤＡＣ的摄取能力。逡逑Ａ逦７８６－０逦７６９－Ｐ逡逑

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