快速灵敏检测热原的稳定细胞系的开发与研究

发布时间：2020-06-15 20:20

【摘要】：热原是一类在宿主体内可以引起发热和诱导炎症反应的异构类化合物。在临床上,热原是指能使哺乳动物产生热原反应的物质。热原按照来源分为外源性热原和内源性热原。外源性热原主要来源于机体外,分别为微生物(如细菌、病毒、真菌)与非微生物(如抗原、抗肿瘤药)性热原,内源性热原主要包括机体内的激素(如类固醇、前列腺素)与细胞因子(如肿瘤坏死因子、干扰素、生长因子、白介素)。使用热原污染的药品和医疗器械会引起系统性炎症,在最糟糕的情况下,则会引起败血性休克。因此,准确和快速量化热原对药品安全是至关重要的。到目前为止,家兔法、鲎试剂法和单核细胞激活试验检测法对于热原的检测都存在限制。在我们的研究中,我们致力于开发一种利用荧光素酶报告系统来灵敏、可靠、快速地检测热原的方法。先前的报道已经表明,细菌鞭毛蛋白可以通过Toll样受体TLR5刺激人肺泡上皮细胞产生细胞因子IL-8。然而,其他的热原物质是如何诱导激活肺上皮细胞还没有完全被阐释清楚。脂多糖(LPS,也被称为内毒素)作为最主要的热原,是细胞因子最有效的细菌诱导剂之一。在感染过程中,热原刺激人的单核细胞去合成或者释放炎症细胞因子,包括白介-1β,白介-6,肿瘤坏死因子-α。而NF-κB是调控编码这些促炎因子基因的主要转录因子。与此同时,人类β-干扰素(IFN-β)通过增强TNF依赖的TNF的产生,显著性增加了正常家兔对内毒素的发热反应,而且也恢复了致敏原耐受的家兔对内毒素的正常发热反应。鉴于此,我们把含有NF-κB应答元件或者IFN-β启动子的荧光素酶基因插入到慢病毒载体中,然后稳定转染到A549细胞中,再经过流式分选单克隆,最后利用荧光素酶报告系统来鉴定单克隆细胞的活性,从而构建出稳定的人A549荧光素酶报告细胞系。我们的结果表明几株NF-κB单克隆稳定细胞对0.1EU/mL的内毒素响应,而这是少于人的发热阈值0.3EU/mL内毒素的。我们进一步使用灵敏度为0.125 EU/mL的鲎试剂与报告细胞比较,这是药物中广泛使用的鲎试剂灵敏度,以评估相同条件下的热原,结果显示报告细胞达到了鲎试剂检测法同等的灵敏度。此外,我们进一步研究报告细胞发现,和原始的A549相比,报告细胞克隆在低浓度内毒素刺激下就能被激活并上调TLR4的表达。这些结果表明以人肺泡上皮细胞为基础的报告实验对于进一步开发可替代的热原检测方法很有潜力同时也是可行的。因此,稳定的荧光素酶报告细胞很有可能进一步发展成为一种既快速又灵敏的热原评估方法。
【学位授予单位】：安徽大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R927.12

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本文编号：2714944