嘧啶类BTK抑制剂的制备及其抗慢性B淋巴细胞白血病的初步药理活性研究

发布时间：2020-06-16 00:44

【摘要】：目的:设计合成一系列2,4-二芳基嘧啶类布鲁顿氏酪氨酸蛋白激酶(BTK)抑制剂,通过初步评价其对慢性B淋巴细胞白血病的抗肿瘤活性,以筛出活性更好、毒性更低更加优良的化合物。方法:本论文的第一部分以BTK抑制剂Spebrutinib为先导化合物,基于分子杂合策略,在其二苯胺基嘧啶骨架的C-2位引入氨基片段,制备一系列新型的2,4-二芳基嘧啶类小分子化合物,共计12个新型化合物;并借助~1HNMR、~(13)CNMR、HRMS、MS对目标分子进行结构鉴定。第二部分以Spebrutinib和Ibrutinib作为阳性对照药,在激酶水平上,通过定量分析酶促反应后剩余的ATP含量来测定BTK酪氨酸激酶半数抑制率(IC_(50));在体外肿瘤细胞筛选中,采用CCK-8比色法,选取BTK高表达的人源B淋巴瘤细胞Ramos和Raji,测定了目标分子在48 h作用下对肿瘤细胞的抑制率IC_(50)值;并采用AO/EB双染法进行染色,考察最优的化合物对肿瘤细胞Ramos的抑制效果;提取正常外周血单个核细胞(PBMC),检测最优化合物对正常免疫细胞的毒性作用;以流式细胞术考察最优化合物对B淋巴瘤细胞的凋亡作用以及对细胞周期的作用机制。结果:第一部分合成纯化获得12个目标分子,并且核磁数据与目标分子结构特征一致,高分辨质谱特征与目标分子分子质量一致。第二部分化合物初步活性测试结果显示,合成的目标分子大多具有良好的抗肿瘤活性,其中D12具有较优的抑制BTK激酶活性,IC_(50)为0.23nM;同时,化合物D10对Ramos细胞和Raji细胞具有很好的活性,IC_(50)分别为10.5μM、19.1μM;AO/EB荧光染色结果显示,与空白组相比,给予化合物D10处理后肿瘤细胞数目明显减少,出现凋亡,细胞核发生固缩;毒性试验中,最优化合物D10对正常外周血单个核细胞(PBMC)几乎没有毒性作用;流式细胞术考察最优化合物D10对B淋巴瘤细胞Ramos的凋亡具有显著的提高,同时将细胞周期抑制了在G0/G1阶段。结论:本研究成功合成得到嘧啶类衍生物;抗肿瘤药理活性初步研究揭示大多数合成化合物具有较强的抑制肿瘤细胞增殖的活性,部分化合物如D10的抑制BTK激酶活性及抑制肿瘤细胞活性要优于阳性对照化合物Spebrutinib,可以作为候选化合物进行更进一步的开发。本文的结构修饰表明:对二苯胺基嘧啶骨架左侧氨基侧链进行结构优化能有效改善药物抗肿瘤活性及毒性,为此类分子的结构优化提供构效关系理论基础。
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R943;R96
【图文】：

示意图,示意图,实验基础,母核

图 3 Spebrutinib 与 BTK 作用示意图(PDB: 3GEN)结合 Spebrutinib 的合成方法[17]，通过查阅文献及本实验室早期实验基础计了下面的合成路线：母核NClN ClR1NClN NHNHOR1NH2NHONO2NHONO2NH2a bc1 2 4a-b3R1= Cl, FR2= H, Cl, MeO

柱形图,细胞的,化合物,凋亡

图 11 化合物 D10 作用于 Ramos 细胞的 AO/EB 染色实验（10 ×）3.5 流式细胞仪检测3.5.1 凋亡分析本实验中应用流式细胞凋亡法考察最优化合物 D10（20 μM、10 μM 和 5 μM）对 Ramos 细胞处理 48 后对 Ramos 细胞增殖的影响。从图 12 可以看出，在 5 μM、10 μM 、20 μM 时凋亡率达到 38.0%, 46.8% 和 83.6%，与空白组呈显著差异，浓度依赖性升高。且从柱形图中可以看出 10 μM 时 D10 与对照药 Spebrutinib 有显著学差异，与 Iburtinib 无显著学差异，达到了很好的抑制增殖的效果。

【参考文献】