铅致HDAC4表达提高及分布异常机理研究

发布时间：2020-06-17 05:43

【摘要】：重金属铅的污染影响着食品品质和安全,危害人体健康。铅对机体多个器官都会产生毒性,而其中中枢神经系统最为敏感。近年来国内外对铅神经毒性机制的研究取得了一系列的进展,然而表观遗传调控在铅神经毒性中的作用仍不是很清楚。目的:探究组蛋白去乙酰化酶4(HDAC4)在铅导致的神经毒性中的作用机制,为铅中毒防治提供一个有力的效应因子。方法与结果:1.研究HDAC4参与铅引起的神经毒性作用过程。以PC12细胞作为研究对象,采用10μM的铅处理24 h,通过q-PCR以及western blot检测HDAC4 mRNA以及蛋白的表达水平,实验结果表明铅暴露后HDAC4 mRNA以及蛋白水平均表现出异常提升的现象。母鼠从孕期开始饮用含有铅(250 ppm)的水,对其子代(21 d)海马中HDAC4 mRNA及蛋白的表达进行检测,结果发现体内铅暴露后HDAC4的表达与细胞上的结果一致。通过添加HDAC4抑制剂(LMK-235)以及基因手段干扰RNA(shHDAC4)观察PC12细胞突起生长情况,实验结果表明LMK-235及敲低HDAC4能够修复铅引起的细胞突起损伤,说明HDAC4参与调控铅神经毒性的过程。2.探究HDAC4核内堆积参与铅神经毒性过程及其核内堆积的上游因子。免疫细胞化学观察铅对HDAC4亚细胞分布的影响和分别提取细胞核与细胞质蛋白检测HDAC4的表达水平,实验发现铅暴露可导致HDAC4在细胞核内堆积。构建核定位信号缺失的HDAC4质粒(ΔNLS2-HDAC4)转染观察细胞突起生长,实验发现阻断HDAC4的进核过程可以回复铅引起的细胞突起损伤,说明HDAC4的细胞核部分在铅暴露后发挥着不良作用。为探究调控HDAC4核内堆积的上游因子,接下来检测铅作用下磷酸酶PP1、PP2A以及激酶CaMK mRNA的表达水平,q-PCR实验结果表明铅暴露后引起细胞内PP1和PP2A表达水平的提高,而CaMK表达减少。基因敲低PP1检测HDAC4的亚细胞分布及观测细胞突起生长情况,实验表明PP1敲低后能够将铅作用下核内堆积的HDAC4重新再分布到细胞质中,而铅暴露下转染shPP1建立损伤修复再损伤实验观测到细胞突起生长出现缺陷,则说明铅暴露通过上调PP1的表达,介导HDAC4进入细胞核的过程,进而调控铅的神经毒性过程。3.探究铅暴露影响HDAC4的共同作用分子EZH2。LMK-235处理检测胞核与胞质蛋白中HDAC4的表达,实验发现LMK-235能够回复铅暴露后PP1的表达水平同时也能够将铅暴露后核内的HDAC4再分布至细胞质中。同时免疫细胞化学检测LMK-235处理后HDAC4的亚细胞分布及其与EZH2的共定位情况,发现抑制剂LMK-235能够重新分布铅作用下核内堆积的HDAC4至细胞质,且EZH2与HDAC4在细胞中能够共定位。蛋白提取过程中添加NEM(N-乙基马来酰胺)和使用类泛素化检测试剂盒检测EZH2的类泛素化水平,实验发现铅能够增加EZH2与HDAC4之间的相互作用和EZH2的类泛素化水平,而LMK-235与ΔNLS2-HDAC4质粒能够回复这种变化。结论:HDAC4在调节铅暴露引起的神经毒性方面发挥了重要作用,且由磷酸酶PP1介导的HDAC4核内堆积被认为是铅作用下神经细胞中的一个关键分子过程。同时HDAC4的异常提升增强了它与一个新的功能伙伴——EZH2的相互作用,首次发现HDAC4促进了EZH2的类泛素化过程,且发现了一条从PP1-HDAC4-EZH2的新路径来阐述铅的神经毒性。
【学位授予单位】：合肥工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS201.6;R99
【图文】：

图 2.1 体内体外铅暴露对 HDAC4 基因表达的影响Fig 2.1 Relative mRNA level of HDAC4 in vivo and vitro exposed by Pb2.4.1.2 铅暴露异常提升 HDAC4 蛋白的表达水平之前的数据表明铅暴露能够异常提升 HDAC4 的 mRNA 表达水平，所以接下来我们来探究铅暴露下 HDAC4 的蛋白水平变化。如图 2.2（A）PC12 细胞铅暴露导致 HDAC4 蛋白异常积累，与此同时在长期慢性铅暴露的 SD 大鼠海马中，HDAC4 的蛋白表达量也显著升高（B），表明 HDAC4 的异常积累与铅所致的学习认知障碍存在关联。这些数据表明 HDAC4 可能是导致铅神经毒性的一个因子。A BHDAC4β-actinCtrl PbHDAC4β-actinCtrl Pb

图 2.1 体内体外铅暴露对 HDAC4 基因表达的影响Fig 2.1 Relative mRNA level of HDAC4 in vivo and vitro exposed by Pb2.4.1.2 铅暴露异常提升 HDAC4 蛋白的表达水平之前的数据表明铅暴露能够异常提升 HDAC4 的 mRNA 表达水平，所以接下来我们来探究铅暴露下 HDAC4 的蛋白水平变化。如图 2.2（A）PC12 细胞铅暴露导致 HDAC4 蛋白异常积累，与此同时在长期慢性铅暴露的 SD 大鼠海马中，HDAC4 的蛋白表达量也显著升高（B），表明 HDAC4 的异常积累与铅所致的学习认知障碍存在关联。这些数据表明 HDAC4 可能是导致铅神经毒性的一个因子。A BCtrl PbCtrl Pb

【参考文献】

相关期刊论文 前10条

1 曹秀珍;曾婧;;我国食品中铅污染状况及其危害[J];公共卫生与预防医学;2014年06期

2 张小敏;张秀英;钟太洋;江洪;;中国农田土壤重金属富集状况及其空间分布研究[J];环境科学;2014年02期

3 蔡秋;张明忠;刘康书;朱明;舒丹丘;王兴宁;卢存仁;栾君明;;饲粮添加铜、铁和锌对牛组织和血液铅和镉含量的影响[J];动物营养学报;2012年03期

4 夏大海;宋诗哲;王吉会;毕慧超;韩哲文;;镀锡薄钢板在功能饮料中的腐蚀行为(英文)[J];物理化学学报;2012年01期

5 叶峻;;食品重金属污染及其防止措施[J];公共卫生与预防医学;2010年03期

6 丁晓雯;杨保刚;张红;章道明;;火锅底料在不同容器中熬煮铅、砷、镉、铝含量变化[J];西南农业大学学报(自然科学版);2006年02期

7 谢惠波,李仕钦;市售爆米花中铅含量分析[J];中国公共卫生;2005年08期

8 侯彦喜;重金属类环境激素对食品安全的生态风险分析[J];河南工业大学学报(自然科学版);2005年03期

9 何祥来,王捍东,袁燕,王宗元;上市肉鸡组织样品中铅、镉、铜、铬含量的测定[J];畜牧与兽医;2005年01期

10 刘宗平;环境铅镉污染对动物健康影响的研究[J];中国农业科学;2005年01期

相关硕士学位论文 前4条

1 刘青;某学院教职工食用蔬菜重金属污染现状分析及对策研究[D];山东大学;2012年

2 卜红宇;四种金属在皮蛋腌制中作用及新型腌制剂的研究[D];华中农业大学;2011年

3 张丽;陶瓷食品包装容器中有害物质的溶出检测研究[D];江南大学;2011年

4 夏玲;火锅底料熬煮过程中镉、铅、铬、砷形态分布研究[D];西南大学;2009年

本文编号：2717160