PD-1受体高亲和力拮抗剂药物的设计及优化

发布时间：2020-06-17 14:47

【摘要】：Fc融合蛋白是以人抗体的Fc片段为支架、通过连接肽合理展示具有生物学活性的多肽或功能性蛋白结构域所获得的新型融合蛋白。Fc融合蛋白的结构、功能、表达体系、纯化工艺以及药理学研究等方面与抗体药物类似,也被认为是一种广义上的抗体类药物。目前已有11种Fc融合蛋白类药物获得FDA批准上市,如依那西普、阿柏西普等。天然PD-1/PD-L1分子间亲和力约为10~(-6)M,亲和力较低,野生型PD-1或PD-L1不能有效拮抗肿瘤微环境中PD-1/PD-L1的结合,逆转免疫抑制信号。如果对PD-1或PD-L1分子进行特异性的突变改造从而提高其亲和力(例如10~(-9)-10~(-10)M),这些突变体就能够发挥与抗体类似的阻断PD-1/PD-L1信号通路的效应。而且,改造后的高亲和受体/配体结合表位与天然受体-配体的作用区域几乎完全重叠,理论上可以发挥比抗体更优的阻断效应。本论文基于天然PD-1分子的结构特征,借助计算机辅助分子模拟技术进行PD-1/PD-L1分子结构的模拟和对接,在保证PD-1分子识别PD-L1分子的表位不发生漂移的前提下,综合考虑影响蛋白分子成药性的关键因素(如亲和力、稳定性等),合理设计了多个PD-1突变位点,获得了包括各突变组合的虚拟库;进一步,借助哺乳动物细胞库技术将设计的突变库展示于哺乳动物细胞表面,利用流式高通量分选技术筛选、富集强阳性克隆,实现PD-1分子的体外亲和力成熟。同时,建立了PD-1分子体内、外评价模型,评价候选分子的生物学活性。具体研究结果如下:1.PD-1高亲和力突变库的设计和构建借助PD-1、PD-L1晶体结构,利用计算机辅助分子模拟、对接技术合理搭建PD-1/PD-L1相互作用复合物空间结构,通过计算机图形学、距离几何学以及分子间相互作用模式(分子间氢键、Van der Waals作用等)从理论上分析PD-1/PD-L1相互识别的关键氨基酸位点。据此设计丙氨酸替换PD-1分子突变体M1-M5,其中M3为对照突变体,经实验确认,理论预测模型正确,M1、M2、M4、M5为PD-1/PD-L1的主要识别表位。在确认理论作用模型PD-1/PD-L1复合物结构合理的基础上,考虑分子极性、分子间氢键、范德华力等因素进行氨基酸替换,对每一种可能的氨基酸替换进行自由能计算,依照能量越低分子越稳定的原理,将自由能低于野生型PD-1分子的氨基酸纳入虚拟库设计的候选突变位点中并构建点突变虚拟库。利用排列组合原理计算虚拟库理论库容量,最终理论库容为2.98×10~6。2.PD-1高亲和力突变体的筛选和初步鉴定(1)基于设计的点突变虚拟库设计兼并引物,合成PD-1突变体分子文库并克隆至膜展示载体(PFRT-TM),随机挑取100个克隆进行测序分析,通过多序列比对分析对测序结果进行质量控制,结果表明在71个测序正确的克隆中所有突变点均为理论设计的突变点,且氨基酸出现频率呈均匀分布。同时71个克隆序列多样性丰富,没有重复序列,即分子库的构建成功率为71%,符合实验需求并可用于后续的细胞库构建。(2)利用实验室已有的哺乳动物细胞展示系统(FRT定点整合),将PD-1突变体库质粒稳定转染至CHO-Flp-In细胞,经过潮霉素B加压筛选获得稳定表达外源蛋白的细胞群,即为哺乳动物细胞PD-1细胞库。(3)利用流式分选技术富集阳性高亲和细胞,经三轮筛选,通过逐步降低PD-L1-biotin浓度的方法(10μg/mL、5μg/mL、2μg/mL)更好地富集强阳性的细胞群。提取第三轮富集后细胞群的基因组,利用特异性引物进行PCR扩增获得目的基因。将目的基因克隆入实验室已有载体PFRT-KIgG1/Fc,经过连接、转化,对阳性克隆进行测序,获得候选分子的序列。(4)将候选分子序列与母本序列进行比对、聚类分析,初步选择9株代表序列,通过CHO-S表达系统对目的蛋白进行大量表达,纯化,获得胞外段目的蛋白;通过结合ELISA、竞争ELISA、亲和力测定实验最终获得一株亲和力提高约1000倍的高亲和PD-1突变体蛋白,命名为463。3.高亲和力PD-1突变体463的生物学活性评价(1)463融合蛋白体外有效结合PD-L1,发挥良好的竞争结合功能:结合ELISA实验结果显示,463可特异性识别PD-1的配体PD-L1/PD-L2,与野生型PD-1相比,463与PD-L1/PD-L2的结合活性明显提高;竞争ELISA实验结果显示,463可有效地竞争阻断PD-1与PD-L1的结合,而野生型PD-1则不能有效阻断。463的阻断活性较野生型PD-1提高约668倍。(2)463能够逆转PD-L1诱导的体外T细胞免疫抑制状态:抗CD3和CD28抗体刺激后T细胞激活,IFN-γ表达上调。PD-L1能够抑制T细胞活化,抑制IFN-γ的分泌。463和Opdivo均可以有效阻断PD-1/PD-L1信号通路,解除T细胞的抑制状态,恢复IFN-γ的表达,且这一逆转效应具有一定的剂量依赖性。(3)463抑制转基因荷瘤小鼠的肿瘤生长:与无关抗体组相比,10mg/kg 463治疗组肿瘤生长抑制率约为72%,2mg/kg治疗组为43%,而阳性对照抗体Atezolizumab(10mg/kg)组为77%,10mg/kg野生型PD-1组为14%,提示463的抑瘤效果明显优于野生型PD-1蛋白,与上市抗体药物有着相似的抑瘤效果。综上所述,PD-1突变体463具有良好的体内、外生物学活性,具有一定的开发潜力和良好的应用前景。
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R914
【图文】：

氨基酸序列,临床试验,抗体

图 1 主要上市 PD-1/PD-L1 抗体临床试验分类[22]随着对 PD-1/PD-L1 相互作用模式的不断深入了解，靶向性的小分子/肽药物研发运而生。Aurigene 公司模拟人 PD-1 胞外段氨基酸序列设计出名为 AUNP-12 的肽衍，通过动物实验验证了其抗 PD-L1 的作用和抑瘤效果；此外，可口服的 PD-1 小分制剂也有报道，代号为 CA-170，通过使用间苯二酚和 3-羟基苯硫酚作为母核与 -二甲基氨基甲酸酯和其它烷基取代的胺连接，得到 13 个胺附加的苯基二甲基氨基酯（AAPD）可以与 PD-1 结合并能够抑制 PD-1/PD-L1 的相互作用[23]。天然 PD-1/PD子间亲和力约为 10-6M[24,25]，野生型的 PD-1 或者 PD-L1 不能作为拮抗分子有效逆瘤微环境中 PD-1/PD-L1 的抑制信号。如果能够人为提高 PD-1 或 PD-L1 的亲和力（亲和力提高至 10-9-10-10M），则高亲和受体分子能够像抗体一样有效阻断 PD-1/PD号轴。而且，由于突变体与天然受体-配体作用表位的重叠面更大，理论上具有比更优的阻断效应。因此，本论文的研究宗旨是研发高亲和力 PD-1 受体拮抗剂。下详述本论文的立题依据和技术路线。

飘带,理论空间,结构域,力学

结果2.结果D-1 与 PD-L1 相互作用复合物理论空间构象机辅助分子模拟技术、力学优化获得的人 PD-1、PD-L1 空比人 PD-1、PD-L1 晶体结构，PD-1 理论空间结构与晶体结SD 值为 0.0026nm，PD-L1 理论空间结构与其晶体结构主链为 0.0014nm，提示获得的理论构象结构可信，选择的力场参

【参考文献】