氧化还原响应性含碘纳米粒子的制备及体外性能研究

发布时间：2020-06-20 18:16

【摘要】：目的:在当今社会中,癌症成为制约人类生命健康的第一大杀手。而在各种癌症中,乳腺癌是广大女性所患的最为普遍的恶性肿瘤之一。常规的治疗方式包括:放射治疗、手术治疗、化学治疗等。但是传统的治疗方式都在一定程度上有一定的弊处,放射治疗和手术治疗会对病人的身心带来巨大的伤害,而化学治疗除对患者身体有一定的副作用外,还受到癌症细胞耐药性的影响,使真正进入到癌细胞中的血药浓度降低,大大降低了治疗效果。近年来,随着纳米医学的发展,纳米药物传递系统(NDDS)成为癌症治疗最有前景的治疗方式,具有诊疗一体的多功能纳米材料,在肿瘤微环境刺激响应性释放药物的纳米载体,多种治疗方式联合治疗癌症的纳米体系可以实现癌症的早期诊断与治疗,大大提高癌症的治疗效果。本研究是制备了一种含有碘原子和二硫键的聚合物纳米粒子,用作CT造影剂和具有氧化还原刺激响应性的纳米药物载体,然后包载抗肿瘤药物阿霉素(DOX)和光敏剂IR780,通过化疗和光热联合治疗来提高乳腺癌的治疗效果。内容:第一部分材料制备阶段:首先通过化学反应合成了含有碘原子的单体化合物,然后通过沉淀聚合反应制备了具有氧化还原响应性的含碘纳米粒子,最后依次包载了DOX和IR780。第二部分材料表征阶段:分别采用了透射电子显微镜(TEM)、动态激光粒度分析仪(DLS)、电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)、紫外-可见-近红外分光光度计(UV-vis-NIR)、荧光分光光度计、红外热成像仪,CT扫描仪等对该纳米粒子做了一系列结构和性能表征。第三部分该纳米粒子的体外性能考察:细胞摄取、细胞毒性和光热治疗效果。方法:首先第一步以3-氨基-2,4,6-三碘苯甲酸和甲基丙烯酰氯为反应物,通过酰胺化反应合成了含碘单体化合物2-甲基丙烯酰(3-酰胺-2,4,6-三碘苯甲酸)(MATIB)。第二步以第一步生成的含碘单体化合物(MATIB)为单体,以含有二硫键的化合物N,N'-双丙烯酰胱胺(BAC)作为交联剂,以偶氮二异丁腈(AIBN)作为引发剂,通过沉淀聚合的方法合成了含碘聚合物纳米粒子(P(MATIB-co-BAC))。为了考察不同交联度下所得含碘纳米粒子的产量的差异、碘含量的差别、粒径大小的变化及在二硫苏糖醇(DTT)下的降解情况,合成了一系列交联度(15 wt%、20 wt%、30 wt%、40 wt%)的含碘纳米粒子。最后以交联度为30 wt%的含碘纳米粒子为载体,依次通过物理作用负载DOX和IR780,得到DOX和IR780同时负载的P(MATIB-co-BAC)纳米粒子(DOX/IR780P(MATIB-co-BAC))。然后对各步所得的产物进行了一系列的表征。采用TEM对该纳米粒子的形貌及粒径大小进行了表征,通过DLS对各步所得的纳米粒子的粒径分布、表面电荷及分散性进行了表征。采用ICP-MS表征了一定交联度下含碘纳米粒子的碘含量。UV-vis-NIR表征了该含碘纳米粒子在浓度为10 mM DTT中,24 h内的降解情况、DOX和IR780在纳米粒子上的负载量、以及在不同pH和不同DTT浓度下的释放情况,并通过紫外吸收特征峰验证了DOX和IR780的成功负载。采用荧光分光光度计表征了游离的IR780和负载DOX/IR780的含碘纳米粒子的特征吸收峰的变化。通过红外热成像仪对不同浓度下的游离IR780和DOX/IR780(MATIB-co-BAC)纳米粒子在2 W cm~(-2)的激光强度下照射10 min内的光热转化性能进行了表征。采用CT扫描仪表征了含碘纳米粒子在不同碘浓度下对X-线的吸收性能。最后对各步所得的纳米粒子做了体外性能的考察。通过细胞摄取实验考察了依次负载上DOX和IR780的纳米粒子在细胞内的分布情况;通过细胞毒性(MTT)实验分别考察了含碘纳米粒子、负载DOX后的含碘纳米粒子、同时负载DOX和IR780后的含碘纳米粒子与游离的DOX在不同DOX浓度下的细胞存活情况,以及不同浓度下游离的IR780、负载IR780的含碘纳米粒子、同时负载DOX/IR780的含碘纳米粒子在光照和非光照条件下的细胞存活率;通过活死细胞染色来进一步考察了光热和化疗联合治疗对乳腺癌细胞的作用。结果TEM结果显示,不同交联度下得到的含碘纳米粒子均呈均一的球形,分散性良好,得到的含碘纳米粒子随着交联度的增大,粒径随之增大。DLS检测结果表明了不同交联度下的含碘纳米粒子粒径分布较窄,多分散系数(PDI)较小,进一步验证了含碘纳米粒子的分散性良好,表面电荷呈现负电性。通过负载上DOX和IR780后,含碘纳米粒子的粒径稍微增大了些,表面电位仍呈负电性。采用ICP-MS来测定不同交联度下的含碘纳米粒子的含碘量,发现随着交联度的增大,含碘量降低,在15 wt%交联度含碘纳米粒子碘含量为59.3%,而40 wt%交联度时碘含量仅为18.3%。二硫键的降解实验发现,随着交联度的增大,含碘纳米粒子的降解速度及最终降解程度增大。40 wt%交联度的含碘纳米粒子在24h后降解了接近90%,而15 wt%交联度的含碘纳米粒子仅降解了不到50%。CT检测结果显示,一定交联度下CT值均随着碘浓度的增大而增大,具有良好的X线衰减性能。综合纳米粒子在不同交联度下的产量、粒径分布、含碘量、降解情况等,本研究选择了交联度为30 wt%的含碘纳米粒子作为负载DOX和IR780的载体。通过载药实验表明,DOX和IR780的载药量在随药物初始浓度升高而升高在一定的初始浓度下,载药量达到饱和。最终DOX和IR780的载药量为28.3%和11.3%。其药物释放实验表明,药物释放具有pH和氧化还原敏感性。随着pH值的降低,其DOX和IR780的释放速率均有一定程度的增大。在DTT存在下,DOX和IR780的释放量均有明显的提高。在DOX/IR780负载的P(MATIB-co-BAC)纳米粒子的紫外吸收光谱中,在490 nm和800 nm处分别出现了DOX和IR780的特征吸收峰,说明了DOX和IR780的成功负载;对比游离的IR780和DOX/IR780 P(MATIB-co-BAC)纳米粒子的荧光光谱结果,发现负载DOX/IR780 P(MATIB-co-BAC)的纳米粒子中IR780的吸收峰发生了一定程度的红移;通过光热升温曲线表明,在IR780浓度为100μg mL~(-1)时,照射10 min后,温度升到52℃,说明该含碘纳米粒子复合物具有良好的光热转化效果。细胞摄取实验结果表明,通过P(MATIB-co-BAC)纳米粒子的传递,DOX和IR780均分布在细胞的不同位置。DOX主要分布在细胞核中,而IR780则分布在细胞质中。与相同浓度下的游离DOX和IR780相对应。MTT实验表明了未负载DOX和IR780的含碘纳米粒子在高浓度(1000μg mL~(-1))下,仍然具有较高的细胞活性,说明该纳米载体具有良好的生物相容性。游离的DOX与单独负载了DOX的含碘纳米粒子,同时负载了DOX和IR780的含碘纳米粒子具有相近的细胞毒性。光照处理后,同时负载DOX和IR780的含碘纳米粒子组具有明显的细胞毒性。通过活死细胞染色实验进一步证明同时负载DOX和IR780的含碘纳米粒子在近红外光照射下具有更明显的细胞毒性。结论本研究成功制备了同时负载DOX和IR780的氧化还原性含碘纳米粒子,用于CT成像及光热-化疗联合治疗乳腺癌。该含碘纳米粒子具有较好的分散性,稳定性及X线衰减性能。其对DOX和IR780的载药量分别为28.3%和11.3%,体外释放结果显示,药物释放具有pH和氧化还原响应性。细胞实验结果显示同时负载DOX和IR780的纳米粒子能较好的进入细胞,在近红外光照下具有良好的光热-化疗联合治疗效果。同时该纳米粒子具有良好的生物相容性,在癌症诊疗一体化和肿瘤联合治疗方面具有潜在的应用前景。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R943
【图文】：

示意图,纳米粒子,示意图,三碘苯甲酸

图 1 DOX/IR780 P(MATIB-co-BAC)纳米粒子的合成示意图Scheme 1. Synthesis of DOX/IR780 P(MATIB-co-BAC) nanoparticles1.2.1.1 化合物单体 MATIB 的合成用天平准确称取 4.0 g（0.0078 mol）的 3-氨基-2,4,6 三碘苯甲酸，加入mL 的两颈瓶中，然后加入 16 mL 分子筛干燥过的 DMA 溶液，将反应物放控超声清洗器中超声一段时间，使反应物完全溶解。完全溶解后，将两颈瓶入温度约为 25 ℃的油浴中，两颈瓶上面依次连接回流管，回流管上面接事有无水氯化钙的标口玻璃弯形干燥管，回流管通水，下面接进水口，上面接水口。使用 5 mL 的注射器吸取甲基丙烯酰氯 2.448 mL(0.023 mol)，以 30 s的速度缓慢滴加到含有 3-氨基-2,4,6 三碘苯甲酸的 DMA 溶液中。滴加完毕将反应体系的温度提高到 50 ℃,在此温度下反应 18 h，然后通过薄层色谱法判断反应是否反应完全。石油醚与乙酸乙酯作为流动相，体积比为 3:2，混匀，取极少量的 3-氨基-2,4,6 三碘苯甲酸用 1 mL 的无水乙醇溶解，作为对

交联度,纳米粒子,透射电镜

科大学硕士学位论文一、 P(MATIB-co-BAC)纳米粒子的制备结果如图 2 所示，我们利用透射电子显微镜对制备的不同交联下度的TIB-co-BAC)纳米粒子进行了表征，通过所拍摄的图片更能直观的观米粒子的形貌、粒径大小、分散性等。从 TEM 图片上可以看出，用沉淀聚合法得到的不同交联度(15 wt%、20 wt%、30 wt%、40 wtTIB-co-BAC)的纳米粒子表面均为光滑的球形，粒径大小均一，分散随着交联度的提高，粒径大小逐渐增大，交联度从低到高，平均粒径155 nm、177 nm、182 nm、215 nm。结果表明，含碘纳米粒子的粒径联度的大小有关，粒径值随着交联度的增大而增大。从通过公式计算数 U（分散系数）可以看出，不同交联度的 P(MATIB-co-BAC)纳米于 1.1，这表明各交联度下的 P(MATIB-co-BAC)纳米粒子在合成过较窄的粒径分布。各步反应的产率仅为 1.2%-10%，主要是由于沉程中反应单体含碘的小分子化合物浓度较低，仅为 2 mg mL-1，（见

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