盐酸二甲双胍抗乳腺癌作用及分子机制的研究

发布时间：2020-06-20 21:52

【摘要】：研究背景及目的:乳腺癌是影响人类健康的严重公共问题,盐酸二甲双胍是临床治疗糖尿病的一线药物,临床使用已达数十年。随着科学研究水平的不断提高和技术的发展,对盐酸二甲双胍的降血糖及其他的药理活性也进行了较多研究,如心脏保护作用,血脂改善作用和可能的抗肿瘤作用。临床前研究结果显示盐酸二甲双胍可影响肿瘤的发病率和死亡率,由此,本课题研究盐酸二甲双胍抗乳腺癌的药理活性,并对葡萄糖小分子对其抗肿瘤活性的影响进行了研究,该研究可推进盐酸二甲双胍治疗或辅助治疗乳腺癌在临床上的应用。方法:(1)二甲双胍对小鼠乳腺癌的作用及机制研究:40只昆明小鼠随机分为生理盐水组(CT)及盐酸二甲双胍组(MT),并接种4T1乳腺癌细胞构建乳腺癌小鼠模型。MT组小鼠按200 mg/kg剂量每天给予盐酸二甲双胍溶液,CT组小鼠每天给予生理盐水,实验周期为14天,每天对小鼠进行一般状况观察,记录小鼠体重及肿瘤体积,并采用代谢组学技术研究盐酸二甲双胍诱导乳腺癌小鼠血浆的代谢重编程。(2)二甲双胍对乳腺癌MCF-7细胞的作用及机制研究:1采用MTT法及流式细胞术研究盐酸二甲双胍对乳腺癌细胞MCF-7的增殖抑制作用及其对细胞周期和凋亡的影响;并进一步研究葡萄糖小分子对盐酸二甲双胍抑制乳腺癌细胞增殖的影响,采用代谢组学技术研究正常环境下盐酸二甲双胍抑制乳腺癌细胞增殖的分子机制以及葡萄糖浓度的改变影响其作用的分子机制;2通过酶联免疫吸附测定法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测MCF-7细胞中的通路相关蛋白,研究其在盐酸二甲双胍抗乳腺癌活性中的作用。(3)二甲双胍抗乳腺癌作用的机制分析:应用生物信息学工具,筛选乳腺癌中差异表达的基因,结合盐酸二甲双胍体内外抑制乳腺癌增殖的代谢组学研究结果,分析盐酸二甲双胍抗乳腺癌的作用机制。结果:(1)二甲双胍对小鼠乳腺癌作用结果:生理盐水组肿瘤体积由310.6±20.8mm~3增至411.3±40.8 mm~3,盐酸二甲双胍组肿瘤体积由373.5±22.3 mm~3减小至185.8±29.4 mm~3(P0.05)。分析荷乳腺癌小鼠血浆代谢组学结果:与对照组相比,主要的差异化合物为柠檬酸,谷氨酰胺,醛固酮,维生素B6等,这些差异化合物涉及三羧酸循环、谷氨酸和谷氨酰胺的代谢及类固醇激素生物合成等通路。(2)1 MTT实验结果显示:盐酸二甲双胍作用于MCF-7细胞24 h后,其IC_(50)值为30.70±1.21 mM;盐酸二甲双胍在系列浓度葡萄糖(5.0 mM、7.5 mM、10.0 mM、12.5 mM、15.0 mM)培养基中作用于MCF-7细胞24 h后,其IC_(50)值分别为21.94±0.68 mM、24.88±0.55 mM、30.70±1.21 mM、31.10±1.39 mM、93.39±5.01 mM;流式细胞术检测细胞凋亡结果显示:二甲双胍作用24 h后,MCF-7细胞凋亡率为(7.29±0.85)%,显著高于对照组(P0.05),且培养基中葡萄糖浓度影响二甲双胍诱导细胞的凋亡,凋亡率与葡萄糖浓度成反比。流式细胞术检测细胞周期结果显示:盐酸二甲双胍作用24 h后阻滞MCF-7细胞于G1期,分析培养基中葡萄糖浓度对二甲双胍诱导细胞周期阻滞的影响结果显示:在葡萄糖浓度为10.0 mM时G1期的阻滞作用最为明显。分析盐酸二甲双胍对MCF-7细胞增值抑制作用的代谢组学结果发现盐酸二甲双胍作用于MCF-7细胞24h后,柠檬酸,苹果酸和谷氨酰胺的含量显著性降低,表明MCF-7细胞中TCA循环和谷氨酸,谷氨酰胺代谢等能量代谢途径受到调控。进一步研究葡萄糖浓度影响二甲双胍抑制MCF-7细胞增殖的作用机制,发现低糖进一步增强了盐酸二甲双胍对TCA循环的调控作用。2 ELISA检测MCF-7细胞中柠檬酸合酶的结果显示:盐酸二甲双胍作用后MCF-7细胞中柠檬酸合酶含量降低,而低糖培养基中MCF-7细胞的柠檬酸合酶含量增多。(3)应用生物信息学工具筛选出乳腺癌中2336个差异表达的基因,结合盐酸二甲双胍作用于荷瘤小鼠和乳腺癌细胞MCF-7的代谢组学结果,发现盐酸二甲双胍可改变TCA循环及谷氨酸和谷氨酰胺的代谢,抑制乳腺癌细胞增殖。结论:(1)盐酸二甲双胍具有抗乳腺癌的活性;(2)盐酸二甲双胍抗乳腺癌作用的机制可能是通过调节TCA循环及谷氨酸和谷氨酰胺的代谢抑制乳腺癌的增殖,诱导细胞凋亡。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R96
【图文】：

体积,代谢物,总离子流,小鼠

图 1.1 MT 组与 CT 组小鼠肿瘤体积。Fig. 1.1 Tumor volume of mice in the MT group and the CT group.小鼠血浆样品代谢组学结果小鼠血浆样品的总离子流图为了研究盐酸二甲双胍对荷瘤小鼠代谢的影响，本实验采用 UPLC-M对各组的血浆样品进行数据采集，由于血浆样品中的代谢物成分复杂集更多的代谢物的信息，本课题采用 T3 和 C18 两种色谱柱，在两种离正离子模式 ESI+，负离子模式 ESI㧟）下进行样本分析，图 1.2 为各个总离子流图。结果显示，每种模式下，各色谱法均呈现了较好的分离

序列,荷瘤小鼠,总离子流,出峰时间

1.2 CT 组和 MT 组荷瘤小鼠总离子流图。（A 为 CT 组所得总离子流图，B 为 MT 得总离子流图。）Fig.1.2 Total ion chromatograms of tumor-bearing mice in CT group and MT group.（Aobtained from the CT group, B is obtained from the MT group.）.2 仪器的稳定性在整个液质分析过程中，为了所获数据的可靠可信，需考察仪器的稳定课题从以下两方面进行考察：（1）在整个序列中每隔 5 个样本加入一针 QC 样品，通过查看每个 Q中各个峰的出峰时间来查看仪器的稳定性以及所得数据是否可信。在本中，分别在不同采集模式下随机选出 5 个离子进行检验，通过计算各个每个 QC 中的出峰时间及峰面积进而得到该离子的出峰时间 RSD 及峰D，以此评价仪器稳定性，进而得知数据是否可信。表 1.4 和表 1.5 分别为 ESI-离子模式下所检验离子的出峰时间 RSD 和峰面积 RSD。

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