多粘类芽孢杆菌J株抗菌物质P1的活性研究

发布时间：2020-06-21 00:00

【摘要】：抗生素一直是治疗细菌感染的关键药物,然而病原体(特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌,MRSA)表现出对许多抗生素类药物有耐药性,本课题组分离鉴定出的多粘类芽孢杆菌J株对病原性细菌和植物病原性真菌有强烈的抑制作用,尤其是对多重耐药性的金黄色葡萄球菌有很明显的杀菌作用。本研究主要分离追踪对MRSA有强烈杀菌作用的抗菌物质。为了获得大量的抗菌物质,通过菌株的选育及单因素试验和正交试验对J株的发酵条件进行优化,筛选出了最优组:种龄18h、接种量6%、温度32℃、初始pH为8、装液量75mL、摇床转速200r/min,培养24h后,获得发酵粗提物是原始发酵产量的2倍,经过分离纯化得到抗菌物质P1。抗菌物质P1的理化性质研究结果表明:该物质性质不稳定极易分解而失去抗菌活性,受温度影响最大、呈酸碱两性,不同的溶剂对其活性有一定的影响,且制备固体时活性损失很大。抗菌物质P1抑菌作用研究结果表明:该物质对葡萄球菌属、芽孢杆菌属和血链球菌有抑菌作用,并测定了最小抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC),最小杀菌浓度(Minimum bactericidal concentration,MBC)和杀菌曲线。抗菌物质P1对金黄色葡萄球菌、甲氧西林敏感性金黄色葡萄球菌(MSSA)、MRSA的MIC值都是64μg/mL和MBC值都是125μg/mL,其4×MIC将10~5~10~6CFU/mL浓度的菌体分别为8h、6h、8h全部杀死;对枯草芽孢杆菌的MIC和MBC分别是32μg/mL、64μg/mL,对蜡样芽孢杆菌的MIC和MBC分别为125μg/mL、250μg/mL,对解淀粉芽孢杆菌的MIC和MBC分别为250μg/mL、500μg/mL,其4倍的MIC对三种芽孢杆菌10~5~10~6CFU/mL浓度的菌体分别为4h、12h、12h全部杀死;对血链球菌有抑菌作用其MIC500μg/mL,而对白喉杆菌没有抑菌效果。抗菌物质P1抗菌效果测定的结果表明:抗菌物质P1对细菌的抗菌效果为杀菌作用。抗菌物质P1对细菌生物被膜形成的研究结果表明:抗菌物质P1对葡萄球菌属、芽孢杆菌属和血链球菌的生物被膜形成有抑制作用,并且抗菌物质P1对葡萄球菌属已形成的生物被膜具有溶解作用,使测试菌株MRSA、MSSA、金黄色葡萄球菌已形成的生物被膜减少35%以上。但是,10×MIC的抗菌物质P1对金黄色葡萄球菌两个主要毒性因子α-溶血素(Hla)和杀白细胞素(PVL)生成没有抑制作用。细胞毒性的研究结果表明:不同浓度的抗菌物质P1的细胞毒性与最大LDH释放量有极显著性差异,16μg/mL的抗菌物质P1的细胞毒性为1.2%;当抗菌物质P1浓度增大时,细胞毒性也随之增大,250μg/mL的抗菌物质P1细胞毒性为6.5%。为了筛选J株中与抗菌物质P1相关的基因,以pRN5101和pIC333质粒等尝试在J株中建立分子操作体系。但是,试验没有获得阳性结果,通过J株生物信息学分析及文献报道:J株有很完善的限制性修饰系统,可以对甲基化和去甲基化的外源DNA都能进行酶切,这就使得在J株建立分子操作体系比较困难。综上所述,通过对发酵技术的优化提高了抗菌物质P1的产量,经过分离纯化进一步研究抗菌物质P1的活性,并从分子水平初步探究了多粘类芽孢杆菌J株的分子操作工具,这为抗菌物质P1作为一种新型抗生素及结构解析奠定基础,也为今后建立J株分子操作工具奠定基础。
【学位授予单位】：西北大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R978
【图文】：

机制,细菌,耐药性,抗生素

第一章绪论2 细菌耐药性.1 细菌对抗生素的耐药性细菌产生耐药性是普遍的现象，在某些细菌中耐药性的传播主要是某种遗传特征的播，细菌对某些特定抗生素具有先天固有耐药性，或者是由于抗生素自身产生变异失活性和细菌为御防抗生素的作用，细菌通常从附近其他细菌通过基因的水平转移而获耐药性基因（图 1）[8]。此外，获得耐药性基因也可通过转化和转导等方式获得遗传。

靶点,抗生素,失活

图 2 抗生素的失活和靶点的改变[12, 13]1.2.2 新型抗生素的开发病原菌对抗生素的耐药性是 21 世纪人类面临的最重要的健康挑战之一，抗生素的过度使用和滥用，加上细菌的自然进化过程，导致了这场危机。在过去的 30 年里，抗生素的发展只有渐进式的进步[14-16]。但随着抗菌药物的广泛使用和滥用，青霉素从最初的对金黄色葡萄球菌有效到目前出现多种抗生素耐药性的金黄色葡萄球菌，临床根据金

【参考文献】