基于丝网印刷电极电化学发光传感器毒素检测方法研究

发布时间：2020-06-21 11:40

【摘要】：生物毒素具有毒性高、相对稳定、难以发现和核查等特点,急需发展灵敏度高、特异性好和抗干扰能力强的毒素检测新方法。电化学发光(Electrochemiluminescenc,ECL)传感器具有灵敏度高、检测范围宽、可控性好、响应快速、抗干扰能力强等优点,特别适用于复杂物质的痕量、超痕量检测,对于生物毒素的检测具有极佳的应用前景。但是传统电化学发光需要集成式电化学发光检测池,检测设备构架过大,比较笨重,往往只能在实验室、医院等固定环境使用,很难便携应用到野外环境;且使用前后需要仔细清洗,消耗大量时间和试剂,若清洗不净则会给检测带来干扰。本研究将电化学反应中心转移到丝网印刷电极(Screen Printed Electrode,SPE)表面,结合磁分离技术和噬菌体展示技术,充分利用丝网印刷电极和磁分离免疫检测的优势,建立了一套灵敏度高、小型便携、操作简化的电化学发光检测毒素新方法体系,论文取得了如下成果:1.基于丝网印刷电极电化学发光传感平台的构建和响应性能分析。构建了基于丝网印刷电极的便携式电化学发光传感平台(SPE-ECL传感器),对丝网印刷电极芯片进行表征,并对仪器主要参数进行优化。该传感器以丝网印刷电极作为电化学反应中心,取代传统的分立三电极体系,具有小型便携、操作简化的特点。结果表明,金电极电化学性能优于石墨电极和铂电极,电极表面金团簇分布均匀,有利于磁微球的富集固定和电极表面修饰。优化后的传感器具有良好的检测稳定性和重现性,可作为后续毒素检测的传感平台。2.基于标记单抗SPE-ECL传感器检测毒素研究。利用“生物素-亲和素”法在磁微球表面固定多抗作为捕获探针,以Ru(bpy)32+标记单抗作为信号探针,构建了SPE-ECL传感器。该传感器对相思子毒素(abrin)检测的线性范围为0.1 ng/mL～1000 ng/mL,ECL强度(Y)与abrin浓度(X)的关系满足线性回归方程Y=83.6241gX+92.285(R=0.9943,n=8,P0.0001),检测限为 0.1ng/mL。灵敏度高,线性范围宽,各组样品平行测定的相对标准差(RSD)在2.5%～16.5%之间,具有较好的重现性。传感器能克服非目标蛋白和复杂环境干扰物对毒素检测的影响,具有良好的特异性和抗干扰能力。可满足牛奶、土样、蜂蜜等模拟样品的分析要求,具有较好的回收率(83.6%～107.0%)。3.基于标记噬菌体展示抗体SPE-ECL传感器检测毒素研究。以噬菌体展示抗体作为电化学发光标记探针,结合磁分离技术,构建了基于SPE-ECL传感器的生物毒素检测方法。噬菌体展示抗体的多拷贝衣壳蛋白提供了更多Ru(bpy)32+标记位点,有效提高了检测灵敏度。传感器对abrin检测的线性范围为5 pg/mL～500 ng/mL,线性回归方程为 Y= 1122.5901gX+3235.284(R=0.9969,n=9,P0.0001),检测限为5 pg/mL,检测灵敏度比抗体作为标记探针时提高20倍。各组样品平行测定的RSD值在1.8%～10.8%之间,传感器具有良好的重现性。传感器能克服非目标蛋白和复杂环境干扰物对毒素检测的影响,具有良好的特异性和抗干扰能力。可满足牛奶、土样、蜂蜜等模拟样品的分析要求,具有较好的回收率(84.3%～104.4%)。4.基于标记亲合体SPE-ECL传感器检测毒素研究。率先在电化学发光检测中应用亲合体作为特异性识别配体,构建了基于SPE-ECL传感器的生物毒素检测新方法。传感器对abrin检测的线性范围为5 pg/mL～500 ng/mL,线性回归方程为Y=1683.838lgX+4495.319(R=0.9963,n=9,P0.0001),检测限为5 pg/mL,检测灵敏度与噬菌体展示抗体作为标记探针时相当,比之抗体提高了 20倍。各组样品平行测定的RSD值在2.9%～10.4%之间,传感器具有良好的重现性。传感器能克服非目标蛋白和复杂环境干扰物对毒素检测的影响,具有良好的特异性和抗干扰能力。可满足牛奶、土样、蜂蜜等模拟样品的分析要求,具有较好的回收率(85.6%～125.5%)。该传感器是拓展亲合体应用方向、丰富ECL传感体系的一次成功尝试。本研究将丝网印刷电极高度集成、操作简化的特点与电化学发光检测灵敏度高、可控性好、响应快速、抗干扰能力强等优势结合起来,分别采用单抗、噬菌体展示抗体、噬菌体展示亲合体作为特异性信号探针,建立了基于丝网印刷电极电化学发光传感器检测生物毒素的新方法体系,可为为户外原位环境监测、食品卫生检验等领域提供技术基础和参考依据。
【学位授予单位】：军事科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R99;TP212.3
【图文】：

工艺流程图,丝网印刷,基本流程,印版

军事科学院硕士学位论文逡逑＝丝网印刷最关键的环节是印版的制备，常采用光化学制版法制版。以丝网为逡逑支撑体，将丝网绷紧在网框上，然后在网上涂布感光胶，形成感光膜，再将底板逡逑密合在版膜上晒版，经曝光、显影，印版上不需要过墨的部分受光固化成膜，将逡逑Ｎ孔封住；印版丨？．网孔不封闭的地方允许油墨透过，在承印物上形成想要的图案ｍ。逡逑丝Ｎ印刷的工艺流程图如下所示（图１．１）：逡逑

示意图,电化学发光,鲁米诺,机理

１．２．１．４邋金属配合物（Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋）逡逑很多金属配合物都可以发生ＥＣＬ反应，尤其是镧系元素如钌、铼、锇等，Ｈ逡逑为其斯诺克跃迁和线忡激发比较大，拥有很好的发光潜力，所以成为人们研究的逡逑重点。迎过不断改变配体进行尝试，人们发现钌的配合物具有良好的电化学和发逡逑光性质。１９７２年，Ｂａｒｄ等人首次发现了邋Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋的ＥＣＬ现象｜２１１，之后NB做－逡逑系列研究工作，研究ｆＫＥＣＬ机理和在分析检测方面的应用，并取得了邋？系列成逡逑１？２５１。三（ＴＰＡ）Ｒｕｂ２＋共应，Ｓ０２＿、Ｃ0２？经逡逑

【参考文献】