Orai1的抑制剂AnCoA4对LPS诱导小胶质细胞活化的影响

发布时间：2020-06-22 16:55

【摘要】：近年来,大量研究表明脑内神经炎症与多种急慢性神经退行性疾病的发生和发展密切相关,如阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)、帕金森病(Parkinson's disease,PD)和多发性硬化(Multiple Sclerosis,MS)等。小胶质细胞是中枢神经系统的免疫活性细胞,在神经炎症中起到了关键性的作用。正常情况下,小胶质细胞呈现静息状态;当大脑遭受损伤或感染时,可迅速被激活发生形态和功能的改变以发挥防御修复的作用,如活化、吞噬、迁移以及释放大量的炎症介质和细胞因子比如肿瘤坏死因子α(TNF-α)、一氧化氮(NO)、白细胞介素6(IL-6)等,引发炎症反应。该炎症反应不仅针对病变区的病原体和组织碎片,也会对周围神经元造成伤害,引起大脑继发损伤。因此,抑制小胶质细胞的过度活化对修复大脑炎症损伤的意义显得尤为重要。Ca~(2+)是细胞内广泛存在的第二信使,它调控着多项生命活动,如细胞增殖,基因转录、细胞凋亡、免疫应答以及神经递质的传递等。在免疫系统中,钙信号对淋巴细胞免疫功能的激活起着重要的调节作用。钙库操纵的钙内流(store operated calcium entry,SOCE)是非兴奋细胞中胞外Ca~(2+)进入细胞最主要的方式,同时它在cAMP的产生、T淋巴细胞活化过程中发挥重要作用。在淋巴细胞中,SOCE是胞内Ca~(2+)增加的主要途径,用来激活细胞因子的表达以及T细胞和B细胞的活化。有研究报道,SOCE对UDP(二磷酸尿苷)和LPS(细菌脂多糖)诱导的小胶质细胞的吞噬作用和炎性因子的释放起重要的调控作用。SOCE的激活需要内质网膜蛋白STIM1(基质相互作用分子1)和质膜上的Ca~(2+)释放激活的钙通道蛋白Orais(其同系物有Orai1,Orai2和Orai3)或瞬时受体电位通道(TRPC)相互作用。AnCoA4,Orai1的特异性抑制剂,药理学研究指出其能与Orai1蛋白的C端相结合,直接抑制在此钙通道发生的钙内流,并且能减少Orai1与STIM1的结合,抑制SOCE。尽管SOCE在小胶质细胞中的作用已经被证实,但引起SOCE的原因复杂,小胶质细胞激活过程中,SOCE发挥作用的分子机制目前尚不清楚。为了探究SOCE在调控小胶质细胞激活过程中是否与Orai1蛋白有关,如若有关,Orai1在此过程中究竟发挥了何种作用,本实验利用小鼠小胶质细胞系BV-2和大鼠原代小胶质细胞,通过使用Orai1的特异性抑制剂AnCoA4,借助酶联免疫吸附试验(ELISA)、钙成像技术和流式细胞术等实验手段来探索Orai1对小胶质细胞活化的影响。结果表明,Orai1的特异型抑制剂AnCoA4在体外培养的原代小胶质细胞和BV-2小胶质细胞中能明显抑制LPS诱导的炎症反应,既能在形态上抑制其活化,使活化态细胞减少,又能在功能上产生抑制作用,减轻炎症反应的发生,减少TNF-α、NO和IL-1β等炎症介质的产生。此外,AnCoA4对LPS诱导的BV-2细胞的增殖和原代小胶质细胞的凋亡均有一定的抑制作用。钙成像结果还表明,在Tg诱导下,小胶质细胞确实存在SOCE且Orai1参与了SOCE的过程,但除了Orai1可能还有其他钙通道和相关蛋白的参与,比如TRPC通道、Orai1的同系物Orai2,Orai3等。综合以上实验结果,本次研究得出的结论是:抑制Orai1可以减少小胶质细胞的过度活化,减轻炎症反应,并在一定程度上抑制小胶质细胞的增殖和凋亡。这为进一步探索小胶质细胞中STIM1和Orai1介导的SOCE提供了新的线索,并为因钙超载引起的小胶质细胞过度活化进而导致的神经系统退行性疾病的深入研究提供了新的可行性依据。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R96
【图文】：

小胶质细胞,免疫荧光,特异性蛋白,细胞计数

华中科技大学硕士学位论文结果1.原代小胶质细胞免疫荧光鉴定纯化的小胶质细胞接种 2~3 天后，待细胞在盖玻片上伸出伪足时，自培养箱中取出做免疫荧光鉴定并计算其纯度。一抗使用 Iba1，二抗使用 CY3，DAPI 染核，在共聚焦显微镜（40×）下观察，结果如下（图 1）：

小胶质细胞,阿米巴,形态发生

图 3 不同浓度的 AnCoA4 对小胶质细胞活性的影响当 AnCoA4 浓度分别为 5 μM，10 μM，20 μM，50 μM，100 μM 时，BV-2胞的活性与对照组相比无显著差异（P 㧐0. 05）。3.AnCoA4 抑制 LPS 诱导的小胶质细胞活化小胶质细胞静息状态下呈杆状或分枝状，细胞胞体较小，突起细LPS 刺激后被激活，形态发生改变，变成圆形或阿米巴样[17]。为了探究能否抑制 LPS 诱导的小胶质细胞活化而导致的形态上的改变，我们做胞形态学观察（图 3）。

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