内质网应激—自噬途径介导apelin-13诱导大鼠H9c2心肌细胞肥大研究

发布时间：2020-06-24 14:59

【摘要】：目的：Apelin为G蛋白偶联受体APJ的内源性配体，具有促进血管平滑肌细胞增殖，促进单核细胞向内皮细胞粘附等作用。本实验室前期研究结果发现，apelin-13可以诱导心肌细胞肥大，且PI3K-Akt-ERk1/2-p70S6K信号途径和PI3K-自噬途径均介导了apelin-13诱导的心肌细胞肥大过程。本课题拟研究apelin-13对NOX4的表达及内质网应激的影响，并在前期研究的基础上进一步探讨apelin-13诱导心肌细胞肥大的内质网应激-自噬机制，揭示apelin-13诱导心肌肥厚的新的作用机制，为开发APJ为心血管药物作用靶点提供新的理论依据。方法: 1. Western Blot：检测大鼠H9c2心肌细胞APJ, Bip, CHOP, LC3-II/I, beclin-1, p62,NOX4, β-Tubulin的表达； 2. SiRNA干扰: APJ shRNA干扰APJ的表达；Bip siRNA干扰Bip的表达；CHOPsiRNA干扰CHOP的表达； 3.免疫荧光标记LC3及氯喹阻断自噬体的降解，观察自噬体的形成;或者使用GFP-LC3示踪观察自噬体的形成； 4. ER tracker-red荧光标记内质网，观察内质网形态； 5. ScepterTM手持式细胞计数器:测量大鼠H9c2心肌细胞直径和体积； 6. BCA定量法：测定大鼠H9c2心肌细胞蛋白含量； 7. CCK-8试剂盒检测apelin-13对细胞增殖的影响； 8. Hoechst33258染色检测apelin-13对心肌细胞凋亡的影响；结果： 1. Apelin-13浓度依赖（0-2μM）和时间依赖性（0-24h）促进心肌细胞内NOX4的表达 2. Apelin-13浓度依赖（0-2μM）和时间依赖性（0-24h）促进心肌细胞内质网应激标志蛋白Bip和CHOP的表达； 3. APJ shRNA抑制apelin-13（1μM）诱导的心肌细胞内质网应激标志蛋白Bip和CHOP的增加； 4. Apelin-13诱导原代心肌细胞自噬体的形成，APJ shRNA抑制apelin-13（1μM）诱导的心肌细胞自噬标志蛋白beclin1、LC3-II/I的表达增加； 5. NOX4抑制剂DPI阻断apelin-13（1μM）诱导的内质网应激标志蛋白Bip和CHOP的增加； 6. NOX4抑制剂DPI阻断apelin-13（1μM）诱导的心肌细胞自噬标志蛋白beclin1、LC3-II/I的表达增加和自噬降解蛋白p62的表达减少； 7.内质网应激抑制剂Salubrinal阻断apelin-13诱导的beclin1和LC3-II/I的表达增加及p62的表达降低；内质网应激诱导剂Tunicamycin对apelin-13诱导的beclin1和LC3-II/I及p62表达均无影响;Bip siRNA和CHOP siRNA阻断apelin-13诱导的beclin1和LC3-II/I的表达增加及p62的表达降低； 8. Apelin-13促进H9c2心肌细胞中GFP-LC3在内质网上表达，提示可能发生了内质网自噬； 9. APJ shRNA抑制apelin-13促大鼠H9c2心肌细胞直径、体积增大和细胞内蛋白含量增加作用；内质网应激抑制剂Salubrinal阻断apelin-13促大鼠H9c2心肌细胞直径、体积增大和细胞内蛋白含量增加作用；内质网诱导剂Tunicamycin增强apelin-13促大鼠H9c2心肌细胞直径、体积增大和细胞内蛋白含量增加作用；自噬抑制剂3MA也可以阻断apelin-13促大鼠H9c2心肌细胞直径、体积增大和细胞内蛋白含量增加作用；Bip siRNA和CHOP siRNA同样具有抑制apelin-13促大鼠H9c2心肌细胞直径、体积增大和细胞内蛋白含量增加的作用； 10. Apelin-13浓度依赖性（0-2μM）促进心肌细胞增殖； 11. Apelin-13浓度依赖（0-2μM）和时间依赖性（0-24h）增加心肌细胞凋亡； 12.内质网应激抑制剂Salubrinal和自噬抑制剂3MA均可阻断apelin-13促大鼠H9c2心肌细胞凋亡作用；Bip siRNA和CHOP siRNA抑制apelin-13促大鼠H9c2心肌细胞凋亡作用。结论：NOX4-内质网应激-自噬途径介导apelin-13促心肌细胞肥大和凋亡调节。
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R966
【图文】：

时效关系,心肌细胞,量效关系

量的 apelin-13：① Control ②0.001μmol/L ③ 0.01μmol/L ④0.1μmol/L⑤1μmol/L ⑥ 2μmol/L，处理细胞 24 小时，western blot 检测心肌细胞中 NOX4的表达。结果显示如图1A：与对照组比较，给予apelin-13 0.001μmol/L、0.1μmol/L、1μmol/L 和 2μmol/L 均可以促进心肌细胞中 NOX4 的表达，且具有统计学意义(p<0.05)。按照实验分组 apelin-13(1μmol/L)分别处理不同时间：① Control ②3h ③6h ④12h ⑤24h, western blot 检测心肌细胞中 NOX4 的表达。结果显示如图 1B：与对照组比较，给予 apelin-13 处理细胞 12h 或者 24h，均可促进 NOX-4 的表达。图 1 Apelin-13 对 H9c2 心肌细胞中 NOX4 表达的量-效关系和时效关系(x±s,n=3;*p<0.05 vs control)(A:量效关系; B:时效关系)Fig.1 The dose and time effect of apelin-13 on the expression of NOX4 in H9c2 cells.Data are means ± SD of 3 independent experiments.( x ±s, n=3;*p<0.05 vs control) (A

时效关系,相关蛋白,心肌细胞,应激

2. Apelin-13 引发心肌细胞出现内质网应激大鼠 H9c2 心肌细胞用 1% 的 FBS 同步化 24 小时后，按照实验分组给予同剂量的 apelin-13：① Control ②0.001μmol/L ③ 0.01μmol/L ④0.1μmol/L1μmol/L ⑥ 2μmol/L，处理细胞 24 小时，western blot 检测心肌细胞中内质网激相关蛋白 Bip 和 CHOP 的表达的变化。结果如图 2A 所示，apelin-13 0.1μmol/L 及以上浓度时开始促进心肌细胞中 Bip 的表达，在 1μmol/L 及以上度时开始促进 CHOP 的表达。其中以 1μmol/L 时对 Bip 和 CHOP 的表达增加为明显。按照实验分组 apelin-13(1μmol/L)分别处理不同时间：① Control ②3h 6h ④12h ⑤24h, western blot 检测心肌细胞中内质网应激相关蛋白 Bip 和 CH的表达的变化。结果如图 2B 所示，apelin-13 时间依赖性的促进心肌细胞中 B和 CHOP 的表达，从 6 小时起开始具有统计学意义，且在 24 小时的时候表达明显。这些结果表明 apelin-13 能够引发心肌细胞出现内质网应激。

【参考文献】