人Kallistatin重组蛋白在CHO细胞中表达及其抗肝癌功能探索

发布时间：2020-06-24 20:17

【摘要】：Kallistatin(KAL)是一种多功能蛋白,具有抗氧化应激、抗血管生成、抗纤维化、抗肿瘤等多种活性。本实验室前期运用酵母工程菌发酵并制得其重组蛋白,用于制备其单克隆抗体时发现效价不高,分析可能由于酵母菌表达重组KAL蛋白的分子构象发生变化而致。于是本文主要构建CHO-K1细胞高表达载体,并筛选高表达KAL蛋白的稳定株,悬浮无血清驯化后,批量表达纯化得到KAL蛋白并探索其对肝癌的作用。本文主要的研究方法和研究结果如下:首先运用基因工程技术构建了含有Kozak序列,人白蛋白信号肽与人工设计的信号肽,穿膜肽TAT与pcDNA3.1、pTT5、pMH3、pMH3EN载体相连的18种载体。用PEI瞬时转染,双抗夹心ELISA检测,选取KAL表达量最高的载体,运用优化的转染条件转染CHO-K1细胞,转染后36 h,消化转移至培养皿中,用筛选浓度G418来筛选,挑取单菌落接种到96孔细胞培养板中,G418继续筛选。7天后ELISA检测细胞上清KAL含量,选取阳性值高(A≥1.0),有限稀释法克隆化。经三次克隆化后,逐渐扩大培养置100 mm细胞培养皿中,成功筛得表达KAL的稳定株。然后悬浮无血清驯化后,批量表达优化,Ni柱纯化得到KAL蛋白,并用SDS-PAGE和Western blot鉴定之。最后用CCK-8和Hoechst 33342染色以及Transwell实验分别检测KAL对肝癌细胞的作用,并用Western blot初步验证KAL对肝癌的可能原因。本研究表明:(1)不同信号肽,穿膜肽对蛋白的分泌表达效果不尽相同,其中本研究使用的一种人工设计的信号肽对KAL的表达量在不同载体都有显著提高。本研究构建的最佳载体是未优化载体的KAL表达量的10倍。(2)运用G418筛选,三次克隆化后成功筛选出表达KAL的CHO-K1的4株稳定株——2F8、4B4、4E7和7D11。悬浮无血清驯化后,继续加维持剂量的G418和采用分次流加培养的方法,10天时培养基中KAL蛋白浓度最高为11mg/L。批量表达Ni柱纯化CHO细胞表达的KAL重组蛋白分子量为60 kD左右,比大肠杆菌(40 kD)和酵母(58 kD)表达的要略大。主要因为CHO细胞翻译后修饰以及有His标签。(3)研究发现KAL能抑制肝癌细胞的生长增殖,Tranwell实验表明KAL可抑制其迁移和侵袭。Hoechst33343染色发现其可诱导肝癌细胞凋亡,其诱导肝癌凋亡的具体机制有待进一步研究。
【学位授予单位】：华侨大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R914;R96
【图文】：

CKN和TKN载体的构建Figure2.3ConstructingthevectorofCKNand..TKN(a)目的片段KAL的PCR合成和切胶回收片段，M:DL2000DNA.Maiker;1,2为PCR回收;3,4为PCR原液

for aminoacids in protein），运用 PCR 在 KAL 的 CDS 启动子前加 Kozak 序列，经 TA 克隆到 pMD19-T 载体上，菌落 PCR 后阳性送测序，与设计后的片段序列相匹配，经 EcoRI 与 NotI 双酶切后连接到相同双酶切后的 pcDNA3.1 和 pTT5 载体上，转化 TOP10 感受态细胞，测序 BLAST 后与预计结果相符。得到的质粒CKN 双酶切一条载体条带 5400 bp 左右，一条为目的基因片段条带 1300 bp 左右。得到的质粒 TKN 双酶切一条载体条带 4200 bp 左右，一条为目的基因片段条带 1300 bp 左右。2.3.2 高表达载体构建鉴定构建不同信号肽与含 TAT 的载体具体同上，本处主要先将穿膜肽 TAT 与His 标签通过普通 PCR 连接到 KAL 成熟肽 CDS 片段上，即得到一条 KAL 成熟肽 CDS 与 6×His 的片段与一条 KAL 成熟肽 CDS 与 TAT-His 标签的片段，然后重叠延伸 PCR 连接到人白蛋白信号肽与人工合成的信号肽，由此得到 四条不同的片段。经 EcoRI 与 NotI 双酶切连接到 pcDNA3.1 载体上后，测序正确，再经相应双酶切连接到 pTT5，pMH3 和 pMH3EN 载体上。

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本文编号：2728301