双重靶向性的重组干扰素γ的制备和抗纤维化活性研究

发布时间：2020-06-24 23:55

【摘要】：肝纤维化发生时活化的肝星状细胞(HSCs)快速扩增并合成大量细胞外基质蛋白(ECM)和组织金属蛋白酶抑制剂,造成ECM蛋白在肝组织内过度沉积,从而引起纤维化。各类抗纤维化药物在临床使用上都面临疗效低下、毒副作用大的困境,而增强药物对纤维化肝组织和活化HSCs的靶向性是解决这些问题的关键。干扰素γ(IFNγ)可显著抑制成纤维细胞的增殖和降低胶原蛋白的产生,但其过短的半衰期和严重的系统性副作用限制了其在临床上的应用。鉴于肝纤维化疾病病人组织中I型胶原的异常沉积和人胎盘生长因子2氨基酸123-144肽段(PIGF-2_(123-144))对I型胶原蛋白出众的高亲性,本研究将PIGF-2_(123-144)片段用于对IFNγ改性,增加其对纤维化肝脏的靶向性和在病变部位的滞留;进一步以特异性识别活化HSCs表面高表达的PDGFβ受体的双环PDGFβ受体结合肽(BiPPB)取代IFNγ的受体识别功能区,赋予其对活化HSCs的靶向性、避免其非特异性作用活性。本研究首次将PIGF-2_(123-144)与BiPPB-mim IFNγ多肽融合,获得了既具备同Ⅰ型胶原蛋白高亲和性结合进而靶向纤维化肝脏的、又可特异性作用于活化肝星状细胞的IFNγ重组蛋白。首先对人PIGF-2_(123-144)的编码DNA序列进行修改、构建了GST-PIGF-2_(123-144)融合蛋白的原核表达质粒,大量表达、亲和纯化后通过ELISA实验确定了该原核表达的GST-PIGF-2_(123-144)融合蛋白具备和I型胶原蛋白高亲性结合。然后通过原核细胞表达了PIGF-2_(123-144)与BiPPB通过3个甘氨酸或6个甘氨酸连接的GST-PIGF-2_(123-144)-BiPPB融合蛋白,纯化后的两种融合蛋白均保留了PIGF-2_(123-144)对I型胶原蛋白的高亲合结合性。接着表达纯化了GST-mim IFNγ和GST-BiPPB-mimIFNγ蛋白,作用于活化HSC-T6细胞,在摩尔数相同情况下GST-BiPPB-mim IFNγ较GST-mim IFNγ更加明显地抑制了MF表型分子标记基因的表达。最后,构建了GST-PIGF-2_(123-144)-BiPPB-mimIFNγ表达质粒,经原核细胞表达和亲和纯化后,GST-PIGF-2_(123-144)-BiPPB-mim IFNγ蛋白具有良好的Ⅰ型胶原蛋白亲和结合性,可显著下调MF表型分子标记基因水平,并明显降低细胞中Ⅰ型胶原蛋白的产生。本文改造的IFNγ重组蛋白特异性强、分子量小、易于制备,特别是具备对纤维化肝脏和活化肝星状细胞的双重靶向性。
【学位授予单位】：西南交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R943;R96
【图文】：

西南交通大学硕士研究生学位论文 第 5 页要高出许多，大量查阅文献后发现双环 PDGFβ 受体结合肽（ bicyclGFbR-recognizing peptide，BiPPB）可以很好地介导与其偶联的纳米粒子或者细胞因活化态 HSCs 摄取，进而减轻药物的毒副作用。但仍然避免不了体循环时对其他器官的影响，并且在纤维化肝脏内的有效药物浓度也有待提高，这引起了我们进的思考与探索[67-69]。

课题设计技术路线

【参考文献】

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本文编号：2728547