龙血素B及其衍生物防治类风湿性关节炎的机制研究

发布时间：2020-06-27 01:12

【摘要】：类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是以手、腕等小关节受累为主的多关节疾病,临床表现为受感染的关节红肿和痛觉过敏,病变持续且反复发作,具有极高的致残率。目前尚未完全阐明RA的发病机制,对临床上如何有效防治RA提出了巨大挑战,抗炎和镇疼仍然是防治RA的主要手段。患者血清中自身抗体的发现逐步揭示RA属于自身免疫疾病,为其免疫抑制治疗提供了理论依据。自身免疫疾病的发病机制主要涉及效应记忆T淋巴细胞(Effector Memory T细胞,T_(EM)细胞)的异常激活和增殖,该过程与T_(EM)细胞膜上电压门控性钾通道Kv1.3过高表达密切相关,药物阻断或基因敲除Kv1.3后,对RA模型动物表现出较强的治疗作用,提示Kv1.3是发现特异性RA免疫抑制治疗药物的新靶点。RA患者主要临床症状之一表现为患病关节剧烈疼痛,缓解RA患者的关节疼痛症状能够显著改善RA患者生活质量。吗啡类药物镇痛效果显著,但具有成瘾性的毒副作用。开发能显著改善RA患者临床症状的非成瘾性镇疼药物十分必要。哺乳动物初级感觉神经元细胞膜上表达有多种类型电压门控性钠通道,其中河豚毒素敏感性(Tetrodotoxin sensitive,TTX-S)钠通道是开发非成瘾性镇疼药物的重要靶蛋白。显然,活性物质倘能同时阻断Kv1.3和TTX-S钠通道,则能产生免疫抑制和镇疼的双重药理作用,从而有望成为开发防治RA药物的优良先导化合物。课题组前期的研究表明查耳酮类化合物龙血素B(Loureirin B,LrB)能够阻断哺乳动物初级感觉神经元上TTX-S钠通道,从而产生良好的镇疼效应,并进一步发现LrB能够抑制哺乳动物外源性和内源性Kv1.3通道。前期的研究提示LrB极可能对RA产生良好的防治效果,为此,本研究拟人工合成LrB,为增加LrB的结构稳定性,本研究同时也合成了LrB的乙酰化产物(Acetylized Loureirin B,AcLrB),拟系统研究合成的LrB和AcLrB对RA大鼠的治疗作用,深入探讨二者防治RA的细胞与分子机制。在本课题研究的第一部分(第二章),采用膜片钳实验检测了合成的LrB和AcLrB对Kv1.3通道的调节作用。电生理实验结果表明,合成的LrB能够浓度依赖性阻断外源性表达在HEK-293T细胞膜上Kv1.3通道电流,其阻断Kv1.3的最大半数抑制浓度(half inhibitory concentration,IC_(50))为6.33±0.49μM。相比于LrB,AcLrB阻断Kv1.3的效果更优,其IC_(50)为2.24±0.15μΜ。此外,AcLrB阻断Kv1.3通道的选择性也要强于LrB,对于Kv1.3的同源蛋白Kv1.1和Kv1.2,AcLrB的阻断效率分别降低了约10倍和100倍。本部分的研究结果提示人工合成的LrB很好的保持了阻断Kv1.3通道蛋白的药理活性,LrB经乙酰化修饰后结构更加稳定,且阻断Kv1.3的效率和选择性均得到一定程度的提高。在本课题研究的第二部分(第三章),仍然采用膜片钳实验技术,分别检测合成的LrB、AcLrB对哺乳动物痛觉相关性电压门控性钠通道的调节作用。结果表明,LrB和AcLrB均能浓度依赖性阻断小鼠背根神经节细胞膜上TTX-S钠通道,IC_(50)分别为6.14±0.51μM和13.69±0.56μM。Nav1.7是哺乳动物初级感觉神经元上主要的TTX-S钠通道亚型,本研究进一步检测了LrB、AcLrB对外源性表达在HKE-293T细胞膜上Nav1.7的调节作用。结果显示,LrB和AcLrB对Nav1.7表现出活性相当的阻断作用,IC_(50)分别为3.97±0.08μM和4.35±0.16μM。本部分的研究结果表明与以往天然提取的LrB活性类似,合成的LrB也能够高效阻断哺乳动物初级感觉神经元上TTX-S钠通道,LrB经乙酰化修饰后仍然保留了相类似的钠通道阻断活性。本课题的前两部分研究(第二章、第三章)表明LrB及其乙酰化衍生物AcLrB均能同时阻断Kv1.3和TTX-S钠通道,强烈提示二者可能具有良好的防治RA药理作用。在本课题的第三部分,采用牛Ⅱ型胶原诱导制作RA大鼠实验动物模型,检测LrB和AcLrB对RA大鼠的防治作用。行为学实验表明,无论是预防组还是治疗组,LrB和AcLrB均能有效的降低RA大鼠行为学评分,让患病大鼠的关节肿胀程度缓解并能提高RA大鼠的疼痛阈值。CT检查显示,LrB和AcLrB均能有效缓解或一定程度上改善RA大鼠骨关节增生病变。HE结果显示,LrB和AcLrB均能减少RA大鼠踝关节的炎性浸润,减少踝关节滑膜增生及软骨病变。ELISA实验检测结果表明,LrB和AcLrB均能显著降低药物治疗组RA大鼠血清中的IL-6、IL-1β等炎性细胞因子的浓度。流式细胞计数检测结果表明LrB和AcLrB均显著抑制RA大鼠外周血总T细胞及CD4~+T细胞亚群增殖。最后采用RT-PCR检测,结果表明RA大鼠模型组中外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC)中炎性细胞因子IL-1β、IL-6及钾通道Kv1.3mRNA表达水平均显著高于空白对照组大鼠;与模型组相比,LrB、AcLrB治疗组中IL-1β和Kv1.3的mRNA表达水平显著降低。本部分研究结果强烈表明LrB及其乙酰化衍生物AcLrB均对RA模型大鼠表现出良好的镇疼和免疫抑制效果。本研究的第四部分(第五章)以植物血凝素(phytohaemagglutinin,PHA)激活的Jurkat T细胞和刀豆球蛋白A(Concanavalin A,ConA)激活的PBMC为细胞模型,联合使用ELISA实验、RT-PCR检测和流式细胞计数技术,进一步探讨LrB和AcLrB免疫抑制的细胞分子机制,并体外检测LrB和AcLrB的细胞毒性。实验结果表明,对于PHA激活的Jurkat T细胞,LrB和AcLrB均可以显著抑制细胞因子IL-2的释放,降低Kv1.3 mRNA和蛋白表达水平。对于ConA激活的大鼠PBMC,LrB和AcLrB均可以显著抑制炎性细胞因子IL-2和IL-17的释放,显著降低Kv1.3 mRNA和蛋白表达水平。CCK8试剂盒检测LrB和AcLrB对大鼠PBMC的毒性,实验结果显示即使10μM高浓度的LrB和AcLrB也未对大鼠PBMC产生明显的毒性作用。本部分的研究结果提示LrB和AcLrB的免疫抑制效应可能与它们降低激活的T细胞Kv1.3表达水平有关。综合以上各部分的研究,本课题揭示了LrB及其乙酰化衍生物AcLrB一方面直接阻断T细胞膜上Kv1.3通道,并能降低激活的T细胞Kv1.3表达水平,进而抑制T细胞的激活增殖和炎性细胞因子释放,从而有效减弱RA大鼠的自身免疫反应;另一方面LrB和AcLrB高效阻断TTX-S钠通道可能是导致RA大鼠痛觉阈值上升的重要药理作用。LrB、AcLrB的免疫抑制和镇疼协同作用提示其在RA防治中的潜在药用价值。
【学位授予单位】：中南民族大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R96
【图文】：

图 1 T 细胞在经历静止期、活化期 Kv1.3 在各 T 细胞亚型上的分布[23]1.4 龙血竭及其活性单体龙血素 B 的免疫抑制作用龙血竭（RESINA DRACONIS）是从我国云南剑叶龙血树（Dracaena

29第 4 日-27 日记录每只大鼠的临床行为学评分、足趾肿胀体积和机械痛阈值，统计值。A、CIA 大鼠平均临床评分统计图；B、CIA 大鼠平均足趾肿胀体积统计图；C、C鼠平均机械痛觉阈值统计图（n=7，mean±SEM，*p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.001）图 4.1 CIA 大鼠的临床评分、足趾肿胀体积、机械痛觉阈值

【参考文献】

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本文编号：2731138