花色苷对晚期糖基化终末产物（AGEs）生成及损伤HUVEC细胞的抑制作用研究

发布时间：2020-06-28 10:55

【摘要】：随着物质生活水平的提高,人们在饮食方面发生了改变,与饮食相关疾病的发病率持续上升。糖尿病是其中最为常见、发病率最高的流行性疾病之一。糖尿病有众多并发症,糖尿病血管并发症则是导致糖尿病病人发病和死亡的首要原因。体内血糖水平持续升高的情况下,会造成晚期糖基化终末产物(Advanced glycation end products,AGEs)生成速度加快,其会沉积在血管壁上,难以消除。研究证实,AGEs与RAGE(the Receptor of Advanced Glycation End products)结合后,激活氧化应激并诱导产生活性氧(ROS),导致细胞因子分泌异常,并激活细胞内的信号通路,最终导致内皮细胞结构的改变和功能的紊乱。因此,降低或抑制AGEs的生成可能会有效延缓和预防糖尿病并发症的发生。目前,许多化学药物已被用于预防糖尿病并发症以及与AGEs相关疾病的治疗。但长期使用可能会出现如胃肠道不适及肝中毒等副作用,因此,天然抗氧化剂成为防治AGEs形成以及治疗糖尿病并发症的最有前景的药物之一。实验室前期已发现APRF和雪菊花色苷均具有抗氧化活性,本研究将进一步考察这两种花色苷体外抑制AGEs生成能力;以人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)为实验材料,研究两种花色苷对AGEs损伤HUVEC细胞的保护作用及相关作用机制。本实验通过体外制备AGEs,采用紫外分光光度法、荧光分光度法和SDS-PAGE等鉴定AGEs的生成;并采用荧光分光光度法、圆二色谱及SDS-PAGE等方法检测 APRF(APRF)(0.125mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL)和雪菊花色苷(ACTN)(0.075 mg/mL、0.15 mg/mL、0.3 mg/mL)体外抑制 AGEs 作用;镜下观察 APRF(0.2 mg/mL、0.4 mg/mL)和 ACTN(0.5 mg/mL、1.0 mg/mL)预处理1 h再加入AGEs(200 μg/mL)作用24 h后对细胞形态的影响;通过DCFH-DA染色检测AGEs(200 μg/mL)处理24 h胞内活性氧(ROS)生成水平;及两种花色苷预处理1 h后再加入AGEs(200 μg/mL)作用24 h后胞内ROS水平的变化;Real-Time PCR 检测 AGEs(200 μg/mL)损伤组、AGEs+ APRF(0.2 mg/mL、0.4 mg/mL)干预组以及 AGEs+ACTN(0.5 mg/mL、1.0 mg/mL)干预组的细胞粘附分子(ICAM-1、VCAM-1)、炎症因子(ICAM-1、VCAM-1、IL-1β、IL-18、CRP、NLRP3、Caspase-1)、和 DNA 修复酶(MTH1、PARP-1)等相关mRNA的转录水平;Western blot方法分别检测AGEs(200 μg/mL)损伤组、AGEs+APRF(0.2mg/mL、0.4mg/mL)干预组、AGEs+ACTN(0.5mg/mL、1.0 mg/mL)干预组细胞的NF-κBp65磷酸化蛋白和总蛋白p38MAPK表达、P-IκB磷酸化蛋白、IκB蛋白、Nrf2总蛋白和核蛋白的表达。结果表明:BSA与葡萄糖在37 ℃、无菌条件下培养6周后生成AGEs;荧光光谱、圆二色谱及SDS-PAGE方法结果显示,与AGEs组相比,两种花色苷均可以体外抑制AGEs的生成;镜下结果表明APRF(0.2mg/mL、0.4mg/mL)和雪菊花色苷(0.5 mg/mL、1.0 mg/mL)预处理后,可显著抑制AGEs损伤HUVECs细胞;DCFH-DA染色实验结果表明花色苷干预受损的HUVECs细胞后,均能够显著降低细胞ROS生成水平;Real-Time PCR实验结果显示,与空白对照组相比,AGEs损伤组细胞内相关因子表达量显著上调。AGEs+花色苷干预组以浓度-剂量(?)estern blot实验结果表明,与空白对照组相比,白对照组相比,各组间细胞p38 MAPK磷酸化蛋白和NF-κB p65磷酸化蛋白、P-IκB磷酸化蛋白以及核蛋白Nrf2表达显著性升高(p0.05),Nrf2、NF-κB p65、p38 MAPK和IκκB蛋白表达未出现变化。说明两种花色苷可以通过抑制AGEs激活血管内皮细胞Nrf2、p38MAPK、NF-κBp65以及P-IκB信号通路而发挥细胞保护作用。以上结果表明两种花色苷均可以体外抑制AGEs的生成并通过抑制氧化应激、降低细胞炎症因子的表达、阻断细胞相应的信号通路,从而抑制AGEs诱导的HUVECs损伤。本实验为APRF和ACTN应用到抗糖化及糖尿病动脉粥样硬化药物研究提供一定的实验依据。
【学位授予单位】：辽宁大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R91
【图文】：

（邋／；＜０．０５勾ＡＧＥｓ组相比差异显著）逡逑１．５．逦３．邋２邋ＢＳＡ／Ｇｌｕｃｏｓｅ反应体系中ＡＣＴＮ对ＡＧＥｓ的抑制作用逡逑图４邋（Ａ）为ＢＳＡ／Ｇｌｕｃｏｓｅ反应体系中ＡＣＴＮ对ＡＧＥｓ生成抑制作用的荧光逡逑强度光谱。图４邋（Ｂ）为ＡＣＴＮ对ＡＧＥｓ生成抑制率结果。与未发生糖基化反应逡逑的ＢＳＡ相比，ＡＧＥ－ＢＳＡ的特征性荧光增加约４．５倍。当ＡＣＴＮ被添加到由葡逡逑萄糖介导的ＢＳＡ反应体系屮时，其荧光强度以浓度－剂量依赖性方式降低。逡逑结果表明，随ＢＳＡ／Ｇｌｕｃｏｓｅ反应体系中添加ＡＣＴＮ浓度的增加，ＡＣＴＮ对逡逑１８逡逑

而同时添加ＡＰＲＦ后，蛋白质的：级结构的ａ－螺旋含量从４０．１２％分逡逑别上升到邋４２．１４％邋（０．１２５邋ｍｇ／ｍＬ）、４４．１８％邋（０．２５邋ｍｇ／ｍＬ）。这表明邋ＡＰＲＦ邋能够稳逡逑定ＢＳＡ的结构并阻止ＢＳＡ发生糖基化（图５）。此外，结果也表明ＡＰＲＦ抑讳ＩＪ逡逑ＢＳＡ结构的损失具有浓度－剂量依赖性。逡逑１９逡逑

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本文编号：2732925