新型跨膜蛋白-脂质体生物色谱制备和应用方法学研究

发布时间：2020-06-29 13:16

【摘要】：跨膜蛋白属于膜蛋白的一种,是镶嵌于脂质双分子层中,两端暴露于细胞膜内外表面的蛋白质,在维持细胞功能方面起到十分重要的作用。跨膜蛋白是目前最主要的药物作用靶点,占到现阶段所有已知药靶的70%。因此,基于跨膜蛋白的药物发现是创新药物研发的重要途径,也一直是世界范围药学领域的研究热点。本课题着眼于跨膜蛋白,建立了一种新型的跨膜蛋白-脂质体生物色谱系统,并从以下三个方面开展论述。1、新型跨膜蛋白-脂质体-硅胶固定相合成与方法学考察跨膜蛋白结构复杂,具有一个或多个疏水性的跨膜区,其纯化重组以及保存都离不开去污剂的存在。但是在去污剂存在的环境下,蛋白的结构和功能均遭到一定的破坏,药物与跨膜蛋白的相互作用也与体内实际情况差别较大。针对体外模拟跨膜蛋白天然构建这一难题,相关学者发展了一系列新的模型和分析技术,其中最具有代表性的就是蛋白脂质体重构技术,其原理是使用各种脂质体重组形成模拟细胞膜环境的人工膜,然后将跨膜蛋白镶嵌于其上,体外模拟跨膜蛋白天然构建和环境,来表征其与药物的相互作用。然而,蛋白脂质体不具备刚性结构,不能作为色谱固定相,因此无法适用于快速便捷的液质联用这类高效的药物分析方法。为了解决这个问题,本章参考了蛋白脂质体重构技术以及本课题组先前已有基础的细胞膜色谱技术,选用细菌视紫红质作为模型蛋白,构建了一种新型的细菌视紫红质-脂质体-硅胶固定相,其原理是使用薄膜超声水化法将多种脂质体结合制备成囊泡状并将细菌视紫红质蛋白镶嵌于其上,而后使用真空涡旋法将细菌视紫红质-脂质体复合物键合上硅胶。制备的同时使用粒径测试仪,扫描电镜,共聚焦显微镜等多种方式考察制备路径中的各项物理参数。固定相制备完成后,使用湿法装柱将合成的固定相填装进色谱柱,使用9-顺式视黄醛作为阳性药,地塞米松作为阴性药考察色谱柱的有效性,使用9-顺式视黄醛连续进样7天考察色谱柱寿命。一系列实验证明,该方法成功将蛋白,脂质体,硅胶三者结合到一起,制备了一种可以作为色谱固定相的新型复合物,通过液质联用进行验证也证明其有效性和寿命符合要求,为之后该方法的进一步推广和应用奠定了基础。2、全二维FZD4-C18柱/TOF-MS色谱系统细胞膜色谱法是生物色谱法的一种,具有快速、灵敏的特点,十分适用于中药复杂体系的活性成分筛选。然而,尽管细胞膜色谱已经经过多年发展,其仍然有两点不足,一是靶细胞膜上含有成百上千种跨膜蛋白,药物与靶蛋白结合的专属性会受到干扰。即使是外源性转入特定蛋白表达载体的高表达细胞系,也无法消除大量细胞生存必须的其它跨膜蛋白的影响。二是靶细胞膜上的目标跨膜蛋白无法准确定量,且蛋白本身丰度低,相互作用分析的准确度和灵敏度会受到影响。因此,本章节在课题组前期细胞膜色谱研究的基础上,结合上一章节的新型固定相研究,发展了一种新型的全二维跨膜蛋白-脂质体生物色谱系统。本课题选取卷曲蛋白受体4,建立了全二维FZD4-C18柱/TOF-MS色谱系统。FZD4是七次跨膜蛋白,属于卷曲蛋白家族的一员,有众多研究证明FZD4是通过影响WNT/β-catenin通路从而导致结肠腺癌,膀胱癌等癌症的潜在靶点。通过构建的全二维色谱系统,筛选中药葛根、黄芩中作用于FZD4蛋白的潜在抗癌活性成分。通过事先建立的中药成分数据库与质谱结果的比对,再排除于空白对照色谱上呈阳性保留的假阳性结果后,本章节在全二维FZD4色谱系统上发现葛根中的潜在活性成分5种,黄芩中的潜在活性成分7种。3、葛根、黄芩中与FZD4可能存在相互作用的活性成分的药效验证本课题已经于上一章节建立了全二维FZD4-C18柱/TOF-MS色谱系统,并从中药葛根、黄芩中筛选与FZD4存在相互作用的潜在抗癌活性成分,从这些成分中挑选能够购买得到的部分成分的标准品即葛根中的葛根素和3'-羟基葛根素,黄芩中的千层纸素A、汉黄芩素与棕榈酸甲酯进行后续实验。为了验证这些成分的抗癌活性,本章节选取人乳腺癌细胞,进行了一系列实验。首先,细胞增殖抑制实验结果显示千层纸素A、汉黄芩素和葛根素对MCF7细胞具有杀伤作用。其次,使用流式细胞仪进行细胞凋亡实验,结果显示千层纸素A、汉黄芩素和葛根素是通过凋亡途径杀伤细胞。随后进行的蛋白免疫印迹实验结果显示汉黄芩素与葛根素能显著降低MCF7细胞中FZD4的表达,其余化合物则不能。最后,使用Discovery Studio 3.0软件进行汉黄芩素、葛根素与FZD4蛋白的虚拟对接,结果显示汉黄芩素、葛根素能通过氢键与FZD4蛋白结合位点的氨基酸相连。
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R91
【图文】：

脂质体,数据表示,粒径,三次

图 2-1 不同超声时间下脂质体的粒径（数据表示为三次实验的平均值±标准差n=3）。Figure 2-1 the size of liposome with different ultrasonic time. Data were expressedmean ±SD (n=3).确定脂质体破碎所需的时间后，对该条件下制备的脂质体用激光粒度分析仪进一步检测，结果如表 2-1 所示，其粒径在 200nm 以下，Zeta 电位为负值，PDI<说明制备的脂质体符合实验所需要求。之后总计十天都对脂质体的这三个参数进测，结果如图 2-2 所示。从图中可以看出粒径，Zeta 电位，PDI 的值在 10 天中有一些变化，但仍保持粒径在 200nm 以下，Zeta 电位为负值，PDI<0.3，尚在可用的范围内，其稳定性符合要求。

微观形态,脂质体,数据表示,电位值

-18-图 2-2 脂质体的（A）粒径，（B）PDI，（C）电位值在 10 天中的变化趋势（数据表示为三次实验的平均值±标准差, n=3）。Figure 2-2 The changing trend of the (A) size, (B) PDI, (C) ZP (mV) of liposome in10 days. Data were expressed as mean ±SD (n=3).（二）扫描电镜能谱一体机的检测结果脂质体-硅胶复合物制备完成后，使用扫描电镜能谱一体机对其进行验证，并比较纯硅胶和复合物的区别。分别取纯硅胶粉末微量以及混悬的脂质体-硅胶复合物 μL 与于检测胶条上，真空喷金处理 10 min 后进行检测，其微观形态如图 2-3 所示。从图中可以看出，在 20000 倍放大条件下，硅胶表面相对较为光滑，而复合物表面能看到有明显包裹及附着的物质，证明脂质体确实包裹于硅胶表面。硅胶及复合物的表

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