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基于氨基酸靶向代谢组学的肾移植术后他克莫司肾毒性生物标志物体系模型建立与验证研究

发布时间:2020-06-30 08:54
【摘要】:研究背景随着以他克莫司为基础的肾移植术后免疫治疗方案应用愈发深入与广泛,他克莫司在长期应用过程中的肾毒性作用日益凸显。传统、保守的他克莫司基础免疫治疗方案使得其急性与慢性肾脏损伤发生率超过90%,造成移植肾功能以4%/年的速度下降,诱发一系列并发不良反应,增加肾移植患者二次肾脏替代治疗的风险,威胁肾移植患者的长期生存质量与生命安全。早期鉴别他克莫司肾毒性并进行有效干预是临床应用中减低他克莫司急性和慢性肾损伤的必要手段。他克莫司药代动力学/药效动力学过程呈现显著的个体差异,导致药物暴露量与毒性效应关系难以简单推断。临床实践多综合考虑药物浓度监测结果、肾功能生化指标与病理切片对他克莫司肾毒性进行非特异性鉴别,进而采取减药、换药或撤药的方式加以干预。然而上述诊断标准的非特异性/亚灵敏性/损伤性特点使得临床终点判断多处于他克莫司肾毒性效应的“既发阶段”,长期、反复的毒性效应过程造成了移植肾的不可逆损伤。探究他克莫司肾毒性的替代临床效应终点是实现早期、有效干预的重要方法,灵敏、特异的生物标志物是近年来被认可的临床效应终点判断指标。代谢组学技术,因其高通量、高灵敏度的特点,成为了生物标志物发掘的有力手段;其中氨基酸类物质与肾脏结构、功能关系紧密,是肾毒性亚临床病理变化指征的关键切入点。通过归纳前人研究,建立关键氨基酸代谢途径与信息节点的靶向分析方法,可以进一步实现氨基酸生物标志物的有效识别与准确判断。将基于氨基酸靶向代谢组学发掘的生物标志物与有效临床(药物、环境、人口)信息结合起来,运用生物信息学中数据提取、分析、判别与整合手段,可以建立针对不同患者的,大数据背景下的,多层次、多角度的个体化生物标志物体系模型,进而实现他克莫司肾毒性“高危人群”有效识别与早期临床干预。黄葵胶囊是由黄蜀葵花乙醇提取物制备而得的中药制剂,在免疫性肾脏病治疗中应用广泛。前期研究已经证实其具有改善蛋白尿、钠潴留,调节血糖、血脂,缓解炎症和免疫反应等药理活性。据此,本研究推测,黄葵胶囊可能影响他克莫司药效,对其毒性效应发挥缓解作用。前期关注黄葵胶囊与他克莫司合用的研究甚少,黄葵胶囊在肾移植后的临床应用较为局限。研究目的探究他克莫司肾毒性临床背景下的危险因素;建立完善的血浆氨基酸靶向代谢组学分析方法(分析前阶段/分析阶段);构建整合临床危险因素和关键氨基酸的生物标志物体系模型并绘制列线图以实现数据可视化;探究黄葵胶囊与他克莫司合用时黄葵胶囊对他克莫司毒性效应的影响,提出优化的临床干预方案。研究方法第一部分:展开系统综述与Meta分析,识别肾移植术后钙调神经蛋白抑制剂(CNI,包括他克莫司和环孢素)肾毒性临床背景下的危险因素。通过电子数据库检索辅助人工核对,对相关回顾性研究文献进行评价。数据分析使用Cochrane推荐的Review Manager 5.2软件操作完成,运用I~2检验和Q检验评估结论显著性与异质性。CNI肾毒性以生化指标、病理切片和药物浓度等常用临床终点效应事件为首要结局;移植肾功能恢复延迟为次要结局。第二部分:建立基于超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱的血浆23种氨基酸靶向分析方法。色谱柱选用Agilent Zorbax SB-C18色谱柱(3.0 mm×150 mm,5μm),通过在流动相中添加离子对试剂(七氟丁酸),实现多种氨基酸有效的色谱保留与分离。质谱检测在正离子多重反应监测模式下完成。第三部分:招募25名健康志愿者进行上臂静脉采血,按顺序分装至EDTA-2K、EDTA-3K、促凝、肝素和枸橼酸采血管中至规定刻度,并于采血管中保存6、12、24h后检测。运用第二部分建立的氨基酸含量测定方法对不同采血管中血清/血浆的氨基酸含量进行分析。使用重复测量方差分析结合球形检验进行不同保存时间的氨基酸含量测定结果比较。运用Student’s t检验分析不同采血管中氨基酸含量测定结果,同时使用Bland-Altman一致性检验和Passing-Bablok回归分析探讨采血管间含量测定差异规律。第四部分:设计回顾性研究,收集122份发生/不发生他克莫司肾毒性的肾移植患者血浆样本,和与上述患者年龄、性别匹配的健康志愿者血浆样本一同纳入“预验证集”,进一步随机选取42份发生/不发生他克莫司肾毒性的肾移植患者血浆样本纳入“验证集”。运用第二部分建立的氨基酸靶向代谢组学分析方法,参照第三部分推荐操作完成样本采集与氨基酸分析。通过模式识别的计算机学习算法筛选氨基酸生物标志物,并同第一部分研究中指征的危险因素整合,构建生物标志物体系模型,绘制列线图以辅助实现良好的临床应用。第五部分:构建大鼠他克莫司肾毒性模型,将模型分为空白对照、他克莫司肾毒性和他克莫司与黄葵胶囊联合使用三组。收集模型不同阶段的大鼠血液与组织样本,进行相应的肾功能生化指标、组织病理和药物浓度分析。表征不同采样时间下氨基酸生物标志物变化,初步验证第四部分研究结论,指征氨基酸生物标志物在肾脏毒性状态下的变化规律,和与常规肾脏功能指标相比的灵敏度与特异性;探究黄葵胶囊与他克莫司合用时,对他克莫司肾毒性效应的影响和其作用机制。研究结果第一部分:研究纳入了12篇回顾性研究中共计2 849例样本进行分析。供体年龄(OR,1.01;95%CI,1.01 1.03;p=0.02),受体移植时动脉硬化(OR,1.44;95%CI,1.04 1.99;p=0.03)与受体CYP3A5*3/*3基因型(OR,2.80;95%CI,2.63 2.98;p=0.00)是具有统计学意义的CNI肾毒性危险因素。亚组分析与敏感性分析表明,供体年龄在亚裔和高加索人种中不存在异质性。第二部分:待测氨基酸在既定的考察范围内均呈现良好的线性关系。日内/日间精精密度、稳定性、累积效应和真实样本再分析结果满足《FDA生物样本分析方法指导原则》(2013版)和《中国药典》(2015版)的相关要求。该方法能够用于有效的健康志愿者和肾移植患者的血浆样本氨基酸分析。第三部分:肝素(其次是EDTA-3K)采血管氨基酸含量测定结果随存放时间变化较小。用于氨基酸检测的血浆样本在采血管中的存放时间推荐不超过6 h。同肝素采血管氨基酸含量测定结果相比,枸橼酸采血管测定结果偏低而抗凝采血管测定结果偏高;EDTA和肝素血浆氨基酸含量测定结果差异具有统计学意义。在超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱检测条件下,EDTA-3K和肝素血浆氨基酸含量测定结果一致性良好。第四部分:胱氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、对称二甲基精氨酸、色氨酸、犬尿氨酸为有效的他克莫司肾毒性生物标志物。上述氨基酸参与了“精氨酸代谢”、“甲基化过程”、“色氨酸代谢”和“支链氨基酸代谢”等关键生化途径。将上述氨基酸生物标志物与第一部分发掘的危险因素整合为生物标志物体系模型,该模型在“预验证集”和“验证集”中得到受试者工作曲线的曲线下面积均0.8。第五部分:动物模型结果显示,黄葵胶囊和他克莫司合用能够有效降低并延缓他克莫司肾毒性的氧化应激效应。其分子机制为降低肾间质纤维化程度、改变肾小管表型与肾小管扩张状态、降低肾间质炎症细胞浸润,但是不影响他克莫司血药浓度。氨基酸生物标志物能够在他克莫司肾毒性早期产生灵敏变化,以对称二甲基精氨酸为代表的生物标志物,其波动值较常规肾功能指标血肌酐和尿素氮更加显著。研究结论供体年龄、受体移植时动脉硬化与受体CYP3A5*3/*3基因型是具有统计学意义的钙调神经蛋白抑制剂肾毒性危险因素,可以作为有效协变量,纳入他克莫司肾毒性生物标志物体系模型。本研究中建立的氨基酸靶向代谢组学分析方法能够对血浆中23种氨基酸进行准确、快速检测;通过控制样本从采集到检测过程中的两个重要变量,采血管类型和采血管中的样本保存时间,能够有效减少测定结果误差。本课题开展回顾性临床研究筛选并验证的基于氨基酸靶向代谢组学的生物标志物体系模型灵敏度高,并在动物模型中得到了初步验证。黄葵胶囊与他克莫司合用可以有效降低他克莫司所致的肾脏损伤,具有广阔的临床应用前景。
【学位授予单位】:中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R969
【图文】:

肾毒性,分子机制,肾小球旁器,他克莫司


基于氨基酸靶向代谢组学的肾移植术后他克莫司肾毒性生物标志物体系模型建立与验证研慢性肾损伤: 肾间质纤维化与肾小管萎缩(IF/TA) 肾小球旁器增生 肾小管钙化

肾损伤,病理变化,治疗药物监测


- 1图 1-2 Tac 肾损伤的病理变化Figure 1-2 Pathologies of Tac nephrotoxicity临床实践中 Tac 肾损伤主要采用治疗药物监测(TDM)、临床表征或病理切片诊断方式,然而多家临床中心尚无统一的判断标准,诊疗方案也不尽相同。临床表征判断依据为:1、持续的血肌酐含量上升 1.6 mg/ml 和/或突然上升基

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本文编号:2735127

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