甘露糖结合的PH敏感靶向递送吉非替尼纳米载体的研制及抗肿瘤研究

发布时间：2020-07-02 04:29

【摘要】：研究背景肺癌是人类常见的恶性肿瘤之一,我国肺癌发病率每年以26.9%的速度增长,持续升高,已占世界肺癌发病率40%,截止至2017年,我国肺癌每年死亡人数达到70万例,发病人数更已上升至每年80万例,其危害性程度愈演愈烈。在所有肺癌病例中,非小细胞肺癌(NSCLC)是主要的亚组(85%-90%),并且与高复发率和高死亡率相关[1]。吉非替尼(Gnb)作为第一代表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFRTKI),已被证实可为EGFR突变的NSCLC患者提供临床益处[2]。对于EGFR基因突变的患者,使用EGFRTKI治疗可取得9-13个月的中位无进展生存期(PFS),而含铂双药联合化疗方案的中位PFS在4-6个月,两者相比有明显的差异。在治疗缓解率方面,TKI组可高达83%,而化疗组仅为36%,TKI组同样有明显临床优势[3,4]。然而,绝大多数最初对Gnb敏感的患者在治疗后6-12个月内会出现获得性耐药(AR),导致治疗失败[5,6]。EGFR药物耐药与以下机制有关:(1)药物活化降低,或者细胞内药物解毒作用得到强化;(2)细胞内的药物转运蛋白活化,药物被排出胞外;(3)细胞周期被中断或细胞死亡过程被限制;(4)药物靶点被改变,靶点的修复性得到强化。因为TKI的抗肿瘤活性并不依赖于EGFR的表达水平,EGFR水平也不是TKI疗效的评价标准,具有高或低水平表达的EGFR细胞可能对TKI敏感,也可能产生耐药性[7],所以,细胞内药物集聚浓度在EGFRTKI疗效中起着重要作用[8]。EGFR TKI自身代谢和药物排出细胞增多都可以导致细胞内TKI的剂量减少从而产生耐药,相反,如果细胞内TKI药物浓度提高,就可以继续抑制EGFR自身磷酸化,抑制MAPK和PI3K/Akt/mTOR信号通路的激活,减少细胞增殖,提高药效[9,10]。随着分子靶向治疗药物在肺癌治疗中应用越发广泛,分子靶向药物治疗中的药物耐药也成为影响其临床应用疗效的急需解决的难点,如何解决分子靶向药物在肿瘤局部的分布积聚及累积浓度不足,降低抗肿瘤分子靶向药物的耐药性,提高药物疗效是肿瘤临床研究高度关注的重要问题[11,12]。近年来,随着材料科技和生物医学等基础科学的进步,纳米科学技术在生命健康领域的应用研究也得到了迅猛发展,尤其是在肿瘤治疗方面。纳米技术融合了材料学、化学、工程学、生物医学等基础学科的优势,以其独特的物理和化学特性为特点构建了一种现代肿瘤医学治疗手段[13]。纳米载药递送系统是一种新型的药物递送系统,与传统的药物递送系统不同,基于纳米颗粒结构的化合物通过主动或被动递送机制在肿瘤部位获得药物浓度的优势[14]。其独特的性能包括体积小,表面体积比大,表面可修饰性强,可封装药物多,循环时间长,容易渗透细胞膜,位点特异性强等[15],有望能够开辟癌症药物输送的新视野、新思路和新方法。近年来纳米载药递送系统研究涉及基础材料主要为聚合物、胶束、树枝状大分子、脂质体、蛋白质等[16-18]。因为其材料功能的不同,纳米载药系统在靶向性、循环时间、细胞内渗透性、刺激敏感性等方面表现各有不同。但纳米靶向载药系统和肺癌分子靶向药物的联合应用研究尚未有报道,两者的联合是否可协同作用增加肺癌分子靶向药物疗效仍是需要研究的命题。肿瘤组织与正常组织相比,不成熟血管丰富、血管内皮细胞间隙较宽、结构完整性差,淋巴回流缺失,因此药物可滞留在肿瘤区域中,这种现象称为实体瘤组织的高渗透性和滞留效应(Enhanced permeability and retention effect,EPR effect)[19]。由于纳米材料粒径介于3-200 nm之间,故可通过肿瘤高渗透性和滞留效应到达肿瘤部位,实现药物被动靶向识别肿瘤,更多的在肿瘤组织富集,提高肿瘤组织中药物浓度,同时减少在正常组织中的分布[20]。此外,根据肿瘤和正常组织所处的微环境及细胞表面受体等生化特征的差异,可以设计出具有生物响应性的纳米载体,实现对肿瘤的靶向治疗[21-23]。大量实验证明,在纳米粒子表面连接靶向肿瘤细胞及组织的抗体、小分子、多聚物等,可明显提高药物的生物相容性和主动靶向肿瘤的能力,降低药物对正常组织的毒副作用[24,25]。胶束是一种新型的纳米药物递送系统,是由亲水性和疏水性链段相间排列而成的高分子物质。聚合物胶束不仅可用于增溶效果,而且可以作为药物载体[26,27],聚合物胶束这种纳米药物递送系统可以提高药物稳定性,延缓释放,提高药效,降低毒性,具有靶向性[28]。与脂质体相比,有更高的负载能力、更强的稳定性,更长的循环时间,其嵌段共聚物易修饰,应用范围更广[29,30]。聚合物胶束的特性,如小尺寸,亲水性壳的特点可避免单核吞噬细胞系统(MPS)摄取,由于高分子量可逃避肾脏排泄,使其成为有效的被动靶向药物递送系统。小分子有机分子、DNA/RNA适配体、肽、碳水化合物和单克隆抗体等配体可附着在胶束表面,不仅增加肿瘤部位的积累,而且通过受体介导的内吞作用增加癌细胞对药物的摄取[31-33]。PH敏感共递送药物以其可控释药的优势成为近年研究热点[34,35]。PH敏感共递送抗癌药可简单利用肿瘤微环境和溶酶体酸性环境实现药物的可控递送,从而降低毒副作用并提高治疗效果[36]。肿瘤微环境PH敏感共递送药物在血液循环中稳定存在,到达肿瘤组织酸性环境后,外壳PH敏感部件脱落,暴露功能化内核并被肿瘤细胞摄取,增加胞内有效药物浓度,提高抗肿瘤效果]37]。本文设计制备了甘露糖标记的基于PLGA的纳米载体M-NP-Gnb,为分子靶向纳米药物的潜在临床应用提供了新思路。在这项研究中,我们设计PLGA形成混合胶束内疏水核心,PEG形成外壳,甘露糖与PLGA-PEG聚合物嵌段缀合并存在于纳米颗粒外表面。由此形成的纳米载体能够通过EPR效应渗入肿瘤组织,增加肿瘤组织中的药物浓度,同时减少其在正常组织中的存在。与传统化学交联的纳米药物相比,该以主客体包合物为物理交联点的纳米药物制备方式更加简便,化学组成更加明确,更有利于实现纳米药物的临床应用,有望作为一种精准纳米药物实现规模化制备和应用。第一部分甘露糖结合的PH敏感靶向递送吉非替尼纳米载体的制备及其相关性质检测目的制备甘露糖结合的PH敏感靶向递送吉非替尼纳米载体,并对其相关性质进行检测。方法1.基于PLGA-PEG嵌段共聚物合成功能化纳米胶束。首先经化学合成PLGA-PEG-NH2和mPEG-聚组氨酸,使其与吉非替尼(Gnb)自组装成纳米混合胶束。其中PLGA形成混合胶束内疏水核心,PEG形成胶束的外壳。2.将D-甘露糖与PLGA-PEG-NH2中的胺基集团结合于纳米颗粒外表面。3.使用动态光散射(DLS)法评估评估纳米胶束的粒径、尺寸分布和Zeta电位表面电荷等参数,并检测此类参数随着pH改变而产生的变化,以评估pH敏感性。4.采用透射电子显微镜(Transmission electron microscope,TEM)观察纳米胶束的微观形貌。5.进行体外模拟药物释放,利用高效液相色谱法分析该纳米胶束载药系统的药物包封率及体外药物释放率。结果1.成功合成甘露糖结合的PH敏感靶向递送吉非替尼纳米载体,合成的M-NP-Gnb纳米胶束粒径为165nm,M-NP-Gnb胶束的尺寸分布较窄,尺寸均一,Zeta电位为-18.5 mV。在碱性条件下(pH=8.5)和中性条件下(pH=7.4),纳米胶束的粒径较小,而在酸性条件下(pH=6.5,pH=5.5)粒径的尺寸与尺寸分布变大,表明M-NP-Gnb具有酸性响应性。2.体外药物释放研究发现M-NP-Gnb表现出95%的高包封率,高达24.7%的载药量,且具有pH敏感性释放模式。缓释24小时后,有大约60%的药物在酸性条件下(pH 5.5)下释放,35%的药物释放药物在中性条件下(pH 7.4)释放。缓释48小时后,酸性条件下纳米胶束的药物接近释放完毕,在中性条件下,仅释放了 48%的药物。结论本部分成功合成了甘露糖修饰的具有靶向递送吉非替尼功能的聚合物纳米胶束M-NP-Gnb,该纳米胶束的尺寸200nm,可适用于用作抗肿瘤药物载体。该纳米胶束M-NP-Gnb具有良好的体外释放率和较高的药物包封率。此外证实了该纳米胶束具有一定的酸性响应性,在酸性条件下,胶束的粒径增大,开始出现溶胀和解离,从而控释载带的药物。由于肿瘤微环境是酸性的微环境,该纳米胶束可以在肿瘤部位富集并释放化疗药物,而在正常组织处减少药物释放,由此可见该纳米载药胶束在癌症治疗领域具有良好的应用前景。第二部分甘露糖结合的PH敏感靶向递送吉非替尼纳米载体的靶向效应和抗肿瘤效果研究目的研究了甘露糖结合的PH敏感靶向递送吉非替尼纳米载体系统对肺癌细胞的主动靶向作用,同时分析了甘露糖结合的PH敏感靶向递送吉非替尼纳米载体系统对靶向药物抗肿瘤效果的影响。方法1.采用MTT法测定细胞的活力。2.采用流式细胞术和免疫荧光技术分析肺癌细胞系对纳米载药系统的摄取情况。3.采用MTT法测定装载Gnb的PH敏感靶向递送吉非替尼纳米载体系统对肺癌细胞的毒性。4.采用流式细胞术通过Annexin-V/PI双染检测技术测定和评估细胞凋亡效应。结果1.在CHO细胞(不表达凝集素受体)中,NP-Gnb和M-NP-Gnb的细胞摄取没有显着差异。而在肺癌A549细胞(表达凝集素受体)中,M-NP-Gnb的细胞摄取明显高于NP-Gnb孵育2小时后的细胞摄取。2.摄取实验结果显示甘露糖标记的M-NP-Gnb纳米胶束摄取能力明显高于NP-Gnb纳米胶束,差异有统计学意义(P0.05)。3.激光扫描共聚焦显微镜结果显示罗丹明标记的M-NP-Gnb与溶酶体lysotracker Green 共定位,而 NP-Gnb 与 lysotracker Green 无共定位。4.MTT法检测结果显示Gnb(游离和包封形式)在肺癌A549细胞中的时间依赖性和浓度依赖性细胞毒性作用。孵育24小时后,M-NP-Gnb的IC 50值为0.85μg/ml,NP-Gnb 为 2.35μg/ml,游离 Gnb 为 4.12μg/ml。5.凋亡实验结果显示与游离Gnb和NP-Gnb比较,M-NP-Gnb可显著诱导A549细胞凋亡,差异有统计学意义(P0.05)。结论纳米胶束能够明显增强与肺癌细胞的相互作用,从而促进肺癌细胞对吉非替尼的摄取。同时,甘露糖结合的PH敏感靶向递送吉非替尼纳米载体系统可以显著提高吉非替尼诱导肺癌细胞凋亡的作用。第三部分甘露糖结合的PH敏感靶向递送吉非替尼纳米载体的体内靶向效应和抗肿瘤效果研究目的研究了甘露糖结合的PH敏感靶向递送吉非替尼纳米载体系统在体内对肺癌细胞的主动靶向作用,同时分析了甘露糖结合的PH敏感靶向递送吉非替尼纳米载体系统提高靶向药物抗肿瘤效果的影响。方法1.裸鼠肺癌异种移植瘤模型的建立;2.高效液相色谱法分析药物在荷瘤小鼠体内的代谢动力学变化和药物摄取分析;3.纳米载药递送系统对裸鼠肺癌移植瘤的治疗效果分析。4.免疫组化分析了纳米载药递送系统的抗增殖效果。5.TUNEL染色检测肿瘤组织中细胞凋亡水平。结果1.体内药代动力学分析显示游离的Gnb在4-6小时内即从体循环中清除,而NP-Gnb和M-NP-Gnb可将Gnb在体内停留的时间延长至24小时。与游离Gnb相比,包封在纳米胶束中的Gnb的半衰期增加约5倍。2.给药后药物浓度分析显示,M-NP-Gnb优先定位于肿瘤组织,且与游离药物相比,肿瘤组织中M-NP-Gnb纳米载药系统递送的Gnb的浓度明显增加。3.体内肿瘤模型实验结果显示,M-NP-Gnb注射组肿瘤生长缓慢,且肿瘤体积低于NP-Gnb和游离Gnb注射组(P0.01);M-NP-Gnb注射组小鼠肿瘤重量明显低于NP-Gnb和游离Gnb注射组。4.免疫组化结果显示M-NP-Gnb注射组肿瘤组织增殖比例明显低于NP-Gnb和游离Gnb注射组。5.TUNEL染色结果显示M-NP-Gnb注射组肿瘤组织细胞凋亡指数明显高于NP-Gnb和游离Gnb注射组。结论本研究显示纳米胶束能够促进所载药物在肺癌组织聚积,从而提高分子靶向药物的抗肿瘤效果,同时,其又能够减少药物在正常组织中的浓度,一定程度上降低药物对正常脏器的毒副作用。在抑制肿瘤方面,纳米胶束能有效抑制荷瘤体积的生长,并抑制肿瘤增殖,促进肿瘤细胞的凋亡,且毒副作用较小,所以该靶向药物纳米载药载体在肿瘤临床方面具有广泛的应用前景。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R943;R96
【图文】：

粒度分布,纳米颗粒,粒度分布,纳米胶

逡逑结合廿露糖后，Ｍ－ＮＰ－Ｇｎｂ胶束粒径尺寸增大到１６５ｎｍ（图１．２３）。而且］＾－液－0１化逡逑胶g?的尺寸分布相对较窄（ＰＤＩ＝０．１５７±０．１２５，邋ｐＨ＝７．４），这意味着本研究中合逡逑成纳米胶束的尺寸较为均匀，粒径分布的直方图（图１．２邋ａ）呈现出一个很明显逡逑的单峰模式，未出现其他杂峰，与典型的纳米胶束粒径分布峰相吻合。以上都证逡逑实了该纳米胶束成功合成，尺寸均一，无杂质出现，而且具有较小的纳米尺寸。逡逑粒径对于纳米药物载体的应用影响非常大［６１］，粒径的最大上限即为最小毛细逡逑血管的直径，一般认为粒径大于１．５Ｍｍ的纳米药物载体就己经不适合应用于静脉逡逑给药，会影响静脉循环甚至阻塞毛细血管。而且大于２００ｎｍ粒径的纳米颗粒也逡逑可能会被脾脏滤除

释放曲线,纳米胶,释放比率,药物释放

在前面的研究中，我们已经证实了该纳米胶g?具有酸性响应性，在酸性环境下，逡逑由于纳米胶束组分中的组氨酸胺基质子化，导致纳米胶束的粒径和粒径分布增逡逑大，胶束的稳定性下降，出现溶胀和解离，导致药物释放。如图１．３所示，在ｐＨ＝７．４逡逑的中性条件下，ＮＰ－Ｇｎｂ和Ｍ－ＮＰ－Ｇｎｂ的药物释放曲线呈现出一个平滑的趋势，逡逑且在缓释早期并没有突释现象的产生，在药物释放４８小时之后，药物的累积释逡逑放比率仅为４８％左右，ＮＰ－Ｇｎｂ和Ｍ－ＮＰ－Ｇｎｂ没有明显差异。而在酸性环境下逡逑（ｐＨ＝５．５），药物的释放比率大大增高，虽然在８小时内的释放曲线仍然呈现出逡逑平滑的趋势，但是在８－１２小时之间，出现了一个明显的药物突释，这可能是胶逡逑束中的组氨酸成分具有一定的质子缓冲能力。缓释２４小时之后，酸性环境下的逡逑ＮＰ－Ｇｎｂ和Ｍ－ＮＰ－Ｇｎｂ药物累积释放比率达到了邋６０％左右，而中性环境下，累计逡逑释放比率仅为３５％左右

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