联合蛋白质组学和代谢组学探讨高胆固醇血症影响肝脏药物转运体的表达规律及临床意义

发布时间：2020-07-03 01:20

【摘要】：药物转运体是一类分布于细胞膜上介导内外源性物质的跨膜转运的蛋白质。作为体内重要的内外源性物质消除器官,肝脏分布着多种药物转运体,如OATP1B1、OATP1B3、OATP2B1、OAT2、OAT7、OCT1、 NTCP等摄入型药物转运体与MRP3、MRP4、MRP6、BCRP (ABCG2)、 BSEP (ABCB11)、MRP2 (ABCC2)、P-GP、MATE1等外排型药物转运体。肝脏药物转运体的生理功能是将大多数内源性物质、外源性药物等摄取入肝细胞,再经肝细胞的药物代谢酶的生物转化,最终将其经胆汁排至体外,因此肝脏转运体对肝细胞在摄取、代谢与排泄内外源性物质的功能方面发挥着重要作用。肝脏药物转运体的表达与功能异常导致血浆药物浓度改变,从而引起其药效学效应变化,可能产生治疗无效,甚至药物蓄积导致毒副作用。肝脏药物转运体的表达与活性常受药物、疾病等多种因素的影响。糖尿病、肥胖等众多疾病都可影响肝脏药物转运体的表达与活性。而目前关于高胆固醇血症影响肝脏药物转运体的表达与活性的报道较少。故本研究拟考察高胆固醇血症影响肝脏药物转运体的表达规律及可能的调控机制,从而揭示高胆固醇血症通过药物转运体产生疾病-药物间相互作用的可能性,为高胆固醇血症患者的合理临床用药提供重要参考。第一章高胆同醇血症血清代谢变化的代谢组学研究实验目的：主要采用代谢组学技术分析高胆固醇血症血清代谢变化,分析受高胆固醇血症影响的代谢通路,初步考察引起血清代谢物变化的可能药物转运体。实验方法：1.采用饲喂大鼠高胆固醇饮食造成高胆固醇血症模型。2.常规生化分析技术检测高胆固醇血症血清生化指标变化。3.非靶向LC-MS/MS的代谢组学技术分析高胆固醇血症血清代谢成分变化。4.多元统计分析研究高胆固醇血症的代谢组特征,并筛选出高胆固醇血症密切相关的标志性代谢物。实验结果：1.大鼠经8周高胆固醇饲料喂养后,高胆固醇血症组大鼠血清总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、TC/HDL-C、LDL-C/HDL-C明显高于对照组(P0.05),但甘油三酯(TG)与对照组无差异,表明高胆固醇血症模型已成功构建。2.与对照组相比,高胆固醇血症组总胆酸、总胆红素、直接胆红素、肌酐、尿素、尿酸都明显升高(P0.05),但血糖、AST, ALT并未升高。生化分析结果初步提示高胆固醇血症存在代谢紊乱。3.代谢组学结合多元统计分析揭示出高胆固醇血症血清中多种差异代谢物升高,如肌酸、肌酐、甘氨胆酸、多种氨基酸如甲硫氨酸等,提示高胆固醇血症存在氨基酸、胆酸与肌酸代谢紊乱。实验结论：高胆固醇血症存在明显代谢紊乱,如胆红素、胆酸、肌酸与氨基酸代谢紊乱。直接胆红素、胆酸等代谢分子的升高提示肝脏中相应的药物转运体的表达与功能可能受到抑制。第二章高胆固醇血症影响肝脏药物转运体的蛋白组学研究实验目的：探讨高胆固醇血症影响肝脏药物转运体的表达规律及可能的调控机制。实验方法：1. iTRAQ标记结合LC-MS/MS的蛋白(质)组学技术分析受高胆固醇血症影响的肝脏差异表达蛋白。2.生物信息学技术,如GO分析、通路分析与上游调控分子分析,筛选受到高胆固醇血症调控的药物转运体及其信号机制。3. RT-qPCR与western blot方法分别从mRNA和蛋白水平确证候选药物转运体表达趋势的可靠性。实验结果：1.蛋白组学结果表明,与对照组相比,高胆固醇血症组差异表达蛋白共有239个,其中上调表达188个,下调表达51个(P0.05,表达变化大于2倍,至少2条可信肽段)。2.GO分析表明差异表达蛋白发挥结合功能,催化活性与转运功能等。参与转运功能的差异表达蛋白中鉴定出MRP2、OAT2等多种药物转运体。与对照组相比,高胆固醇血症大鼠肝脏的MRP2与OAT2表达下降。3.通路分析与上游调控分子分析表明OAT2与MRP2既受到多种核受体调控,亦受到炎症因子调控。4. RT-qPCR与western blot方法表明高胆固醇血症大鼠肝脏MRP2与OAT2的表达下调,证实蛋白组学鉴定结果的可靠性。实验结论：iTRAQ标记结合LC-MS/MS的蛋白组学、生物信息学、RT-qPCR与western blot等技术鉴定出高胆固醇血症下调肝脏药物转运体MRP2与OAT2的表达。其次,药物转运体MRP2与OAT2的表达受到核受体与炎症因子调控,提示炎症性疾病高胆固醇血症可能通过炎症因子抑制核受体功能继而下调肝脏表达药物转运体MRP2与OAT2。第三章高胆固醇血症下调药物转运体MRP2与OAT2表达的机制研究实验目的：探索高胆固醇血症调控MRP2与OAT2表达的分子机制。实验方法：1. RT-qPCR与western blot方法分析高胆固醇血症影响的肝脏核受体变化趋势。2. Western blot方法考察LXRα激动剂对高胆固醇血清或炎症因子TNF-α所下调MRP2与OAT2的表达影响。3.流式细胞术分析LXRα激动剂对高胆固醇血清或炎症因子TNF-α所下调MRP2转运活性的影响。实验结果：1.与对照组相比,高胆固醇血症组肝脏LXRαmRNA表达明显下降(P0.05),CAR mRNA表达则明显上升(P0.05),其他核受体FXR. PXR、PPARy mRNA表达无明显变化；LXRα蛋白表达也呈同样趋势(P0.05)。结果提示LXRα与CAR可能参与高胆固醇血症下调肝脏表达MRP2与OAT2。2.与正常血清相比,高胆固醇血清下调HepG2细胞的MRP2与OAT2表达(P0.05),但LXRα激动剂T0901317能回复高胆固醇血清所下调MRP2与OAT2表达(P0.05)。同样,与对照组相比,TNF-α下调HepG2细胞的MRP2与OAT2表达(P0.05),但LXRa激动剂T0901317能回复TNF-a所下调MRP2与OAT2表达(P0.05)。结果进一步证实高胆固醇血症通过下调LXRa功能来抑制肝细胞表达MRP2与OAT2。3.与正常血清相比,高胆固醇血清下调HepG2细胞的MRP2外排底物CDCFDA (P0.05);但LXRa激动剂T0901317能回复MRP2外排活性(P0.05)。同样,与对照组相比,TNF-a下调HepG2细胞的MRP2外排底物CDCFDA (P0.05);但LXRa激动剂T0901317能回复TNF-a所下调MRP2外排活性(P0.05)。结果证实高胆固醇血症通过下调LXRa功能来抑制肝细胞MRP2的转运活性。实验结论：高胆固醇血症通过抑制核受体LXRa信号通路来下调肝脏的MRP2与OAT2的表达与活性。升高的炎症因子TNF-a至少部分介导高胆固醇血症的上述作用。第四章高胆固醇血症下调药物转运体MRP2与OAT2活性的临床意义分析实验目的：考察高胆固醇血症患者是否存在MRP2与OAT2的活性降低现象。实验方法：1.比较高胆固醇血症人群与正常对照人群的MRP2底物直接胆红素与OAT2底物尿酸与肌酐的血清浓度。2.分析血脂水平与MRP2及OAT2底物血清水平的相关性。实验结果：1.与正常对照组相比,高胆固醇血症组患者的BMI、收缩压、舒张压、TC、LDL-C、HDL-C、TG、AST、ALT、总胆红素、间接胆红素、尿素都明显升高(P0.05)。而两组间年龄、性别、血糖、总蛋白、球蛋白、白蛋白则无统计学差异。2.与正常对照组相比,高胆固醇血症组患者的直接胆红素明显升高(P0.05),提示肝脏MRP2活性降低。同样,高胆固醇血症组患者的尿酸与肌酐明显升高(P0.05),提示OAT2活性降低。3.相关性分析表明TC及LDL-C与直接胆红素、尿酸、肌酐等都成正相关,且具统计学差异(P0.05)。TG仅与尿酸、肌酐等成明显正相关(P0.05),HDL-C与尿酸、肌酐存在微弱的负相关。上述结果提示TC、LDL-C水平可能是影响MRP2与OAT2活性的重要因素。实验结论：高胆固醇血症患者的MRP2与OAT2的转运活性降低,且此变化与TC及LDL-C水平呈正相关。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R96
【图文】：

为了明确ＬＸＲａ激动剂能否对抗炎症因素高胆固醇血清导致的ＬＸＲａ表达下逡逑调，故选用人肝癌细胞株ＨｅｐＧ２细胞，设ＮＳ（邋１％）、ＨＣＳ（邋１％）、ＨＣＳ（邋１％）＋Ｔ０９０１３１７逡逑（１０山加等Ｈ种处理，观察ＨｅｐＧ２细胞的ＬＸＲａ蛋白表达水平。如图３．４所示，逡逑与正常血清（ＮＳ）相比，高胆固醇血清明显下调ＨｅｐＧ２细胞的ＬＸＲａ蛋白水平逡逑（Ｐ＜０．０５），但ＬＸＲａ激动剂Ｔ０９０１３１７能回复高胆固醇血清下调的ＬＸＲａ蛋白水逡逑平（Ｐ＜０．０５）。结果一方面提示所选用１＾０１0１处理浓度（１０邋较为合适，另一逡逑方面提示高胆固醇血清能下调肝细胞ＬＸＲａ表达，但ＬＸＲａ激动剂却能对抗之。逡逑Ｐ＜０．０５逡逑Ｃ邋１．５ｉ逦逦逡逑Ｐ＜0－0５邋Ｉ逦Ｉ＿逡逑ｌｘｒ逦ｆｍｉｉＭｉ＇．ｉｍｉｉｉｉｉｎｔ一。逦一Ｆ邋Ｉ邋佽踊逡逑ｐ－ａｃｔｉｎ逦ｉｌ＇５．逦曲逦｜！｜逡逑ｒｊｌ，邋Ｉ邋Ｈ邋Ｗ逡逑ＮＳ逦ＨＣＳ逦ＨＣＳ＋Ｔ０９０１３１７逡逑图３．４ＬＸＲＵ激动剂Ｔ０９０１３１７回复高胆固薛血清所下调的ＬＸＲｔｔ蛋白表达逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３．４邋ＬＸＲｕ邋ａｇｏｎｉｓｔ邋Ｔ０９０１３１７邋ｒｅｓｃｕｅｄ邋ｈ－ｖｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉｃ邋化ｒｕｍ－ｒｅｐｒｅｓｓｅｄ邋ＬＸＲｕ逡逑ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｉｎ邋ＨｅｐＧ２邋ｃｅｌｌｓ逡逑２．５邋ＬＸＲａ激动剂回复炎症因子ＴＮＦ－ａ所下调的肝细胞ＬＸＲａ表逡逑达逡逑由于血清是由多种成分组成的复合物，因此不清楚到底其中何种成分能下调逡逑ＬＸＲａ表达。文献报道高胆固醇血症常引起人血清中ＴＮＦ－ｏｕ邋ＥＬ－ｌｐ等炎症因子升逡逑高ｔｗｉ。同时

ｉ：ｉｎ邋■逡逑ＮＣ逦ＨＣ逡逑图４．４两组间ＭＲＰ２底物直接胆红素比软逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋４．４邋Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ邋ｏｆ邋ＭＲＰ２邋ｓｕｂｓｔｒａｔｅ邋出ｒｅｃｔ邋ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ邋ｂｅｔｗｅｅｎ邋ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓ化ｒｏｌｅｍｉａ逡逑ａｎｄ邋ｎｏｒｍａｌ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｇｒｏｕｐｓ逡逑＃：邋Ｐ＜０．０５邋ｖｅｒｓｕｓ邋ＮＣ逡逑２．５邋０ＡＴ２底物肌酌、尿酸逡逑ＯＡＴ２介导血清中多种内源性底物的消除，如肌酌、尿酸等Ｐ’ｓｉ，故测定血清逡逑肌醉、尿酸含量，Ｗ评估ＯＡＴ２的转运活性。如图４．５Ａ所示，ＨＣ组患者肌巧显逡逑著高于１＾（：组。＜０．０５），分别为８１．化１５．８＾ｕｎｏｌ／Ｌ与６６．■７±１２．９＾ｍ＾ｏｌ／Ｌ；如图４．５８逡逑所示尿酸亦是同样趋势（？＜0．0５），分别为３６２．８±７２．１邋ｎｍｏｌ／Ｌ与巧０．５±６２．４邋＾ｉｍｏＵＬ。逡逑结果提示高胆固醇血症下调ＯＡＴ２转运活性。逡逑Ａ逦Ｂ逡逑１５０－｜逦５００－１逦＃逡逑ｆ逦＃逦｜４。。－逦十逡逑１５０．逦１２。。－逡逑０１邋Ｉ逦１邋Ｉ逦Ｑ邋N．Ｊ逦Ｉ邋■逦—逡逑ＮＣ逦ＨＣ逦ＮＣ逦ＨＣ逡逑图４．５两组间ＯＡＴ２底

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