重组irisin在毕赤酵母中的表达及其对人胰腺导管癌抗癌活性的研究

发布时间：2020-07-03 23:10

【摘要】：民众生活水平的逐渐改善以及运动的缺乏,导致肥胖及2型糖尿病患者的数量不断增加,也使得癌症的发病率不断增长。现代医学的发展对于癌症的控制已经取得很大的进展,但由于癌症的复杂性和化疗药物的毒副作用及耐药性,癌症仍然是全球范围内死亡率最高的疾病。已有研究证实锻炼及改善肥胖可以降低癌症的发病率以及复发风险,对肿瘤的辅助化疗起到积极作用,但相关作用机制仍在研究中。Irisin是近些年发现的一种骨骼肌伴随运动产生的肌因子,在体内分布广泛。研究表明irisin可以调节体重,并影响各种代谢性疾病,其中包括肥胖、2型糖尿病(T2DM)、脂质代谢和心血管疾病(CVD)、非酒精性脂肪肝(NAFLD)等。Irisin还可以通过上调过氧物酶体增殖物活化受体(PPAR)γ辅助活化因子1α(PGC-1α)和解偶联蛋白1(UCP1),诱导白色脂肪组织的褐变。此外,作为运动相关的肌肉及脂肪因子,irisin在癌症患者体内水平的改变和irisin对多种癌症的体外影响及其机制研究已经得到了许多关注。因此,irisin有潜力成为治疗某些癌症的药物。本研究中,主要开展了三部分工作:第一部分,利用毕赤酵母(P.pastoris)真核表达系统,构建了重组irisin的表达体系,表达并纯化了糖基化修饰的E-irisin。针对已有报道的irisin对癌细胞生长的抑制作用,验证本研究中真核表达重组E-irisin和原核表达重组P-irisin的抗癌活性,并评估了重组irisin对几种肥胖相关癌症的影响。第二部分,主要研究重组irisin对胰腺导管癌细胞的增殖、迁移、侵袭的抑制作用及其作用机制。第三部分,探讨了irisin与化疗药物阿霉素(Doxorubicin,DOX)共同作用对诱导胰腺导管癌凋亡的影响和可能的作用机制。第一部分:毕赤酵母真核表达重组E-irisn及重组irisin的抗癌活性测定根据P.pastoris密码子偏好合成了含有6×His tag的irisn序列;利用EcoR I,Not I将目的基因连接到表达质粒上,成功构建pPIC9K-irisin;将其线性化并导入至P.pastoris宿主菌GS115中,经G418抗性筛选获得高拷贝的GS115-pPIC9K-irisin转化子;进一步对P.pastoris表达条件进行了优化,以最佳诱导时间为96h、最佳甲醇剂量为1%、最佳温度30°C、最佳pH为6.0诱导获得了重组蛋白,并经免疫亲和实验(Western blot)和过碘酸希夫染色(Periodic Acid-Schiff stain,PAS)染色鉴定确认,纯化后得到糖基化修饰重组E-irisin。利用真核来源重组E-irisin和原核来源重组P-irisn,验证了本实验中的重组irisin对乳腺癌、肺癌均具有一定的抑制作用,与已有报道结果相符。此外,我们还发现重组E-irisin和重组P-irisn对胰腺导管癌MIA PaCa-2细胞也呈现出抗肿瘤活性,但对于肝癌细胞BEL-7402、人急性早幼粒细胞白血病NB4、人多发性骨髓瘤RPM18226均未见明显作用。第二部分:重组irisin对胰腺导管癌细胞MIA PaCa-2增殖、迁移、侵袭的抑制作用及作用机制免疫荧光分析显示irisin在MIA PaCa-2细胞膜表面可能存在有未知受体。MTT和细胞克隆形成实验表明,重组E-irisin和P-irisin均具有抑制MIA PaCa-2细胞的生长,抑制细胞克隆形成的能力。流式细胞术分析显示重组E-irisin和P-irisin会使MIA PaCa-2的细胞周期阻滞于G0/G1期,降低周期蛋白Cyclin D1的水平。划痕实验和Tanswell实验表明,MIA PaCa-2细胞的迁移和侵袭也受到抑制,并且重组E-irisin和P-irisin通过改变上皮-间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)过程中的标志蛋白E-cadherin、vimentin的表达,抑制MIA PaCa-2细胞EMT过程。另外,本研究还发现重组E-irisin和P-irisin激活了细胞中生物能量代谢调节的关键分子AMP依赖的蛋白激酶(AMPK),引起MIA PaCa-2胞内哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路的抑制,进而下调其靶分子p70核糖体蛋白S6激酶(p70S6K),真核翻译起始因子4E结合蛋白1(4E-BP1)的磷酸化,影响细胞中蛋白质的代谢。但本研究中未发现重组E-irisin和P-irisin在抑制胰腺导管癌过程中的显著区别,推测irisin是否进行糖基化修饰并不影响其在MIA PaCa-2细胞中的活性。第三部分:重组irisin对胰腺导管癌DOX化疗敏感性的影响本研究发现irisin可以显著降低DOX在MIA PaCa-2和BxPC-3细胞中的IC_(50)值,增强低浓度DOX的抗癌活性,并能提高MIA PaCa-2和BxPC-3胞内caspase-3和PARP蛋白的剪切激活,降低BCL-2和BCL-xL的表达,增加DOX引起的MIA PaCa-2和BxPC-3细胞凋亡。在MIA PaCa-2和BxPC-3细胞中,irisin下调了丝氨酸/苏氨酸激酶AKT,核转录因子kappa B(nuclear factorκB,NF-κB)p65的磷酸化,上调了DOX引起的抑制核因子κB(IkB-α)的下降,通过抑制磷脂酰肌醇三激酶PI3K/AKT和NF-κB信号通路增强了MIA PaCa-2和BxPC-3细胞对DOX的敏感性。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R91
【图文】：

图 1.1 Irisin 对通过 ERK 和 p38 信号途径调节脂肪棕化生热re 1.1 Recombinant irisin regulates the thermogenic program in fat th and p38 pathways [41]isin 在心血管方面的作用近些年来的研究证实，irisin 是一种参与调节心血管功能的多肽，可作疾病和心血管疾病的治疗手段。研究表明，幼龄大鼠和年老雄性大鼠的骼肌产生更多的 irisin[42]。irisin 还可以激活中枢神经系统，进而协调

够保护成肌细胞和心脏线粒体功能，改善缺血再灌注损伤，调节组蛋白去乙酰化酶 4 而起到对缺氧/复氧引起的心肌损伤的保护作用[49, 50]。同时，irisin 信号在压力过载时对左室肥厚、重构和功能障碍的发展也至关重要，通过诱导保护性自噬和激活独立于 mTOR /S6K 的 AMPK/ULK1 信号通路，irisin 可以改善慢性压力超载受损的自噬流量，从而防止心脏肥大[51]。 随着科研人员对 irisin 在心血管方面功能的研究深入，进一步解释了运动及肥胖与心血管疾病的联系，同时也为心脏再生的治疗提供了新的思路。如图 1.2，为近些年关于 irisin 在包括心血管疾病在内的代谢疾病调节中的角色。

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本文编号：2740300