新型纳米核酸制剂对黑色素瘤A375细胞酪氨酸酶表达和增殖的影响

发布时间：2020-07-04 08:00

【摘要】：目的:设计、制备可干预黑色素合成的新型纳米核酸制剂,并研究其对黑色素瘤A375细胞酪氨酸酶基因表达、细胞增殖及凋亡的影响。方法:1.设计针对酪氨酸酶(Tyrosinase,TYR)靶点的siRNA,通过实时荧光定量PCR筛选出抑制TYR mRNA效果最好的siRNA,用蛋白质免疫印迹法进一步分析TYR-siRNA对TYR蛋白表达的影响。2.通过实时荧光定量PCR检测TYR mRNA相对表达水平,通过流式细胞仪检测凋亡率和细胞周期,比较不同浓度的TYR-siRNA、小眼畸形相关转录因子MITF(Microphthalmia-associated transcription factors)-siRNA对TYR mRNA的相对表达水平及其对A375细胞凋亡、周期的影响。3.选出最佳靶点和最佳浓度的siRNA,制备纳米核酸制剂。通过激光共聚焦显微镜观察A375细胞对纳米核酸制剂的摄取情况。4.运用实时荧光定量PCR检测纳米核酸制剂对A375细胞TYR mRNA的相对表达水平,运用MTT法、DAPI染色法、流式细胞仪检测法研究纳米核酸制剂对A375细胞增殖、形态学变化和凋亡的影响。5.采用单因素方差分析对结果统计分析。结果:1.实时荧光定量PCR筛选出siRNA-2为干扰TYR mRNA效果最好的siRNA,同时蛋白质免疫印迹法验证其在蛋白水平上同样抑制TYR的表达(P0.05)。2.TYR mRNA表达量与TYR-siRNA浓度存在剂量依赖效应,随siRNA浓度增大而降低(P0.05),细胞凋亡率与TYR-siRNA浓度存在剂量依赖效应,随浓度增加而增大(P0.05)。3.TYR-siRNA阻滞细胞周期的S期,存在浓度依赖效应(P0.05)。4.TYR mRNA表达量和MITF mRNA表达量与MITF-siRNA浓度存在剂量依赖效应,随siRNA浓度增大而降低(P0.05),细胞凋亡率与MITF-siRNA浓度存在剂量依赖效应,随浓度增加而增大(P0.05)。5.MITF-siRNA阻滞细胞周期的G0/G1期,存在浓度依赖效应(P0.05)6.激光共聚焦显微镜观察纳米核酸制剂能被A375细胞摄取。7.纳米核酸制剂干预A375细胞后,TYR mRNA相对表达量降低(P0.05),细胞增殖率降低(P0.05),激光共聚焦显微镜观察发现细胞核形态发生改变,能促进细胞凋亡(P0.05)。结论:1.TYR-siRNA和MITF-siRNA均能有效抑制黑色素合成的关键酶TYR的mRNA表达,并能诱导黑色素瘤A375细胞凋亡。2.TYR-siRNA和MITF-siRNA对细胞周期的影响不同,siRNA达到300 pmol时,尤其是MITF-siRNA,细胞出现异常增殖,因此确定TYR为作用靶点。由于剂量依赖效应,选用200 pmol浓度制备纳米核酸制剂。3.本研究制备的纳米核酸制剂可以被黑色素瘤A375细胞摄取。4.纳米核酸制剂能抑制TYR mRNA表达,抑制细胞增殖,使细胞核形态皱缩、产生异染色质,从而促进细胞的凋亡。5.纤维状纳米核酸制剂较球状纳米核酸制剂转染siRNA的效率更高,更能有效抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。
【学位授予单位】：河北大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R965
【图文】：

转染,细胞

A 转染后 A375 细胞 TYR mRNA 的相对表达A2 抑制 A375 细胞 TYR 蛋白的表达 siRNA2 对抑制 TYR 表达的能力，Western 蛋白表达水平。图 2-2 结果显示，siRNA2 转

转染,细胞,黑色素瘤

图 2-2 TYR-siRNA2 转染后 A375 细胞 TYR 蛋白的相对表达量（*P<0.05，2.4.3 TYR mRNA 表达量随 TYR-siRNA2 浓度升高而降低分别将 100 pmol、200 pmol、300 pmol 的 TYR-siRNA2 转染进黑色素瘤细胞后，利用荧光定量 PCR 检测得到 A375 细胞 TYR mRNA 相对表达量。

【相似文献】