将硒代半胱氨酸传送进入细胞的一种基于蛋白衣壳的传递系统

发布时间：2020-07-04 21:14

【摘要】：目前,硒代胱氨酸作为潜在癌症治疗药物被深入研究。其化学结构与胱氨酸的化学结构类似,但胱氨酸中的硫元素被硒元素取代,从而形成了硒代胱氨酸特有的化学特性,但也赋予了其广泛的生物毒性。硒代胱氨酸的化学特性和生物学特性源于其结构中的二硒键。含有二硒键的小分子如硒代胱氨和硒代谷胱甘肽,他们在酵母和细菌中都能够催化蛋白质氧化折叠。相对巯基来说,硒基具有较低的酸度系数(巯基的酸度系数为8.3,硒基的酸度系数为5.2),而较低的酸度系数能够使硒基形成稳定的阴离子而从分子中离开,因此在氧化反应中硒基作为离去基团具有较大的优势。此外,硒基还可快速与大气中氧气反应生成二硒键,从而在动力学方面使氧化反应更加有利。然而研究显示,硒代胱氨酸对广泛的癌细胞具有较高的毒性,其半数致死量为微摩尔数量级。但正因为其对癌细胞没有特异性,限制了它作为临床药物的应用性,因此我们需要开发新的药物载体使硒代胱氨酸具有针对单一癌细胞的特异性。从超嗜热菌中分离纯化出的二氧四氢喋啶合酶(AaLS)是一类蛋白质衣壳,具有极大潜力被发展为纳米载体用于硒代半胱氨酸的传递。AaLS由十二个五聚体组成具有六十个单体的蛋白衣壳。在每个五聚体的中心有一个8.9埃的小孔,小于1000 Da的小分子可以通过这个小孔进入蛋白质衣壳。在之前的研究中,AaLS的外表面(R108C)已经被修饰用于连接如硼替佐米和阿霉素的抗癌药物。为了在AaLS中引进靶向特性,他们对两种短肽进行研究,其一,他们设计在70和71的位点引进RGD4C环状短肽,其可以通过二硫键的生成在分子内形成一个环,识别活化内皮细胞表面过量表达的整合素αvβ3受体。其二,他们在AaLS的碳末端连接SP94短肽,它可以特异性结合肝癌细胞表面的受体从而达到靶向特性。他们对AaLS的研究展现了AaLS蛋白衣壳作为传递治疗分子载体的显著性,我们可以对AaLS进行内部和表面的简单修饰以提高他的载药性能和靶向特性。在本研究中,我们所用的是一个之前已被设计的蛋白衣壳AaLS的变体AaLS-IC。AaLS-IC的内表面具有一个单一的半胱氨酸残基(E122C),并且去除了野生型AaLS中原有的半胱氨酸(C37A)以避免蛋白衣壳与小分子客体间的错误连接。之前课题组成员用此变体AaLS蛋白衣壳包裹了一个含有巯基的小分子抗癌药物姜黄素(Cur-SH)。通过实验,已经证明通过巯基与二硫键交换反应,可以使Cur-SH以70%的产率被载入AaLS-IC蛋白质衣壳中,而Cur-SH可被5mM的TCEP在两个小时内释放。通过AaLS-IC的包裹,Cur-SH在水溶液中的溶解度显著提高,因此可证明AaLS-IC可以优化小分子作为潜在药物的特定性能。由于硒代胱氨酸是一类潜在的抗癌药物,但缺乏对特定细胞的靶向性,且硒代胱氨酸中二硒键相对于Cur-SH中的巯基来说较为稳定,因此我们将硒代胱氨酸作为小分子药物客体,将其与AaLS-IC中的巯基反应,并评估将AaLS-IC蛋白质衣壳发展为药物传递系统的可能性。硒代胱氨酸中的二硒键和蛋白质衣壳中的巯基反应热力学上很不稳定,但此反应的副产物硒基可快速与氧气反应生成二硒键,这一过程在动力学上为载药反应提供了反应动力。为研究硒代胱氨酸与AaLS-IC蛋白衣壳反应的最佳条件,我们优化了反应时间与反应物比例以得到最大化的反应产率。我们用DTNB和NTSB分析结合的比色法测定反应产率,通过DTNB分析,我们观测载药后硒代胱氨酸与AaLS-IC蛋白衣壳复合物中自由巯基的量。我们发现随着硒代胱氨酸与蛋白衣壳反应比例的增加,在蛋白衣壳中有反应活性的巯基随之减小,并在硒代胱氨酸与蛋白衣壳反应比例为6时达到零,表明在反应比例为6时硒代胱氨酸已经占据了所有在蛋白衣壳中能够与DTNB反应的巯基。为测定反应时间对载药产率的影响,我们也测定了在不同反应时间下的反应产率。结果表明,当反应进行3个小时的时候,已经没有可与DTNB反应的巯基残留在蛋白衣壳中。因此我们判定最佳反应条件为:将硒代胱氨酸与蛋白衣壳以6:1的比例混合,在室温下反应3小时便可达到最佳反应产率。然而DTNB与AaLS-IC蛋白衣壳间的反应并不能达到100%的产率,其原因还有待进一步考量,但同时也证明DTNB分析法很有可能低估了硒代胱氨酸与蛋白衣壳间的反应产率,因为硒代胱氨酸很有可能与一些不能和DTNB反应的巯基进行反应。于是我们引进了NTSB分析法对载药反应的产率进行测定。NTSB不仅可与蛋白衣壳中的自由巯基,硫硒键进行反应,还可与二硫键进行反应,但理论上我们已知硒代胱氨酸反应的蛋白衣壳中不存在二硫键。在NTSB分析法中,为准确测定硫硒键的含量,我们先用过量的碘乙酰胺与蛋白衣壳中的自由巯基反应以封闭自由巯基的反应性,再将其与NTSB反应以测定衣壳中硫硒键的含量。在此法中,我们可以通过测定硫硒键的含量直接测定载药反应的产率。以DTNB分析法测定的反应产率为75%,以NTSB分析法测定的反应产率为81%,由于NTSB分析法以一种更为直接的分析法测定反应产率,且相对于DTNB分析法来说更为准确,于是我们认为硒代胱氨酸与蛋白衣壳的最终反应产率为81%。且反应后,在蛋白衣壳中真正的客体分子为硒代半胱氨酸。同时,AaLS-IC蛋白衣壳也呈现出了一种特殊的结构特性,在AaLS蛋白衣壳中,我们引入了独有的半胱氨酸残基,为其包载硒代胱氨酸提供了化学基础。坚固的蛋白外壳降低了两半胱氨酸结合形成分子内二硫键的可能性,半胱氨酸在蛋白衣壳内表面的位置也降低了两半胱氨酸反应生成分子间二硫键的可能。为证明这一假设,我们同时设计了两种半胱氨酸在蛋白外表面的AaLS变体。一个是五聚体AaLS-IC,其半胱氨酸的位置与AaLS-IC一致,但我们破坏了其60聚体的衣壳结构,使其不能聚集为球形衣壳,只保留五聚体蛋白质,使其巯基裸露在表面。另一个AaLS变体是AaLS-EC,在此变体中,我们保留蛋白衣壳的球形结构,但改变了半胱氨酸的位置,使其暴露在蛋白衣壳表面(E70C)。我们将硒代胱氨酸分别与这两种AaLS变体反应,反应条件与AaLS-IC和硒代胱氨酸的反应一致,反应后,我们利用SDS-PAGE和分子排阻色谱分析反应产物,结果显示,两种反应的产物中都含有部分二聚体蛋白,但AaLS-IC与硒代胱氨酸的产物中没有发现二聚体蛋白的生成,因此半胱氨酸的位置对于载药反应来说极其重要,我们不能忽视位置的重要性。作为潜在的药物传递系统,我们需测定硒代半胱氨酸是否能被普通的还原试剂如谷胱甘肽从AaLS-IC衣壳中释放出来。由于在癌细胞中谷胱甘肽的含量通常在1 mM至10 mM之间,因此我们取用1 mM的谷胱甘肽作为还原剂,测定在此浓度下的谷胱甘肽能否断裂AaLS-IC衣壳中的硫硒键。结果显示,3小时过后,已有半数硒代半胱氨酸从蛋白衣壳中释放出来,并且在48小时内,被包裹的硒代半胱氨酸可全部从蛋白衣壳中释放,此结果表明1 mM的谷胱甘肽已经足够释放蛋白衣壳中的硒代半胱氨酸。为进一步测定还原剂对硒代半胱氨酸释放的影响,我们采用更强的还原剂二硫苏糖醇断裂衣壳内的硫硒键,在此实验中,我们发现用二硫苏糖醇释放的初始释放速率较用谷胱甘肽的释放速率有轻微的加快,但最终的释放率相同。作为空白对照实验,我们并未在硒代半胱氨酸与蛋白衣壳的复合物中加入任何还原剂,将此复合物放置48小时,之后检测游离硒代半胱氨酸的含量,结果显示,在空白对照中并未检测出任何游离硒代半胱氨酸的释放。总的来说,无论用谷胱甘肽还是二硫苏糖醇作为还原剂,硒代半胱氨酸都可完全从AaLS-IC衣壳中释放,而空白对照实验也证明此释放过程可被还原剂诱导,由于癌细胞较健康细胞有较高的谷胱甘肽含量,因此这种释放特性可在癌细胞中得到应用。为鉴定包裹硒代半胱氨酸的AaLS-IC蛋白衣壳在细胞内的表现,我们进行了细胞毒性与细胞摄取实验。我们选取了六株细胞系,其中包括五株癌症细胞(宫颈癌细胞HeLa S3,肠癌细胞HCT116,乳腺癌细胞MCF7,活跃性前列腺癌细胞PC3,惰性前列腺癌细胞LNCaP)和一株健康细胞(鼠胚胎纤维原细胞MEF),对硒代胱氨酸,包裹硒代半胱氨酸的AaLS-IC蛋白衣壳和空蛋白衣壳进行细胞毒性测试,利用MTT法检测活细胞的数量。结果显示硒代胱氨酸对这六个细胞系具有广泛的细胞毒性且半数致死量在低浓度值范围内,由此再次证明硒代胱氨酸具有较高的细胞毒性,且毒性涉及范围较广。包裹的硒代半胱氨酸对宫颈癌细胞HeLa S3,肠癌细胞HCT116,乳腺癌细胞MCF7,活跃性前列腺癌细胞PC3都具有高低不同的毒性,由此表明AaLS-IC蛋白衣壳可以将硒代半胱氨酸传递进入细胞,并释放其中的硒代半胱氨酸,使其表达毒性作用。而未包载硒代半胱氨酸的空AaLS-IC蛋白衣壳并未对这六株细胞表现出明显的毒性,从而证明包载硒代半胱氨酸的AaLS-IC蛋白衣壳所表现的细胞毒性仅来自于在衣壳内的硒代半胱氨酸产生,同时也再次证明了AaLS-IC作为潜在药物传递系统的优势。为了进一步探测AaLS-IC蛋白衣壳在细胞内的位置,我们进行了细胞摄取的实验。由于硒代半胱氨酸并没有明显的荧光或者紫外吸收,因此我们在AaLS-IC蛋白衣壳内包裹了另一荧光分子,以便在荧光显微镜下观察蛋白衣壳的位置,利用DAPI和CellTracker分别对细胞核和细胞质进行染色,以便区分细胞内各部分机体。基于实验结果,我们发现包裹硒代半胱氨酸的AaLS-IC蛋白衣壳的细胞毒性与蛋白衣壳的位置之间存在着微妙的联系,对于包裹硒代半胱氨酸的蛋白衣壳具有较高敏感性的细胞系(IC_(50)较低),蛋白衣壳可聚积在这些细胞系的细胞核中,对于包裹硒代半胱氨酸的蛋白衣壳具有较低敏感性的细胞系(IC_(50)较高),蛋白衣壳可聚积在这些细胞系的细胞质中,而对于那些未能将蛋白衣壳摄取进入细胞的细胞系,包裹硒代半胱氨酸的蛋白衣壳则没有对细胞显示出明显的细胞毒性。这一现象可以帮助我们更好的对蛋白衣壳的外表面进行进一步设计,从而赋予其对细胞的靶向特性。总的来说,我们的研究显示了硒代半胱氨酸可以被载入AaLS-IC蛋白衣壳中,且每个蛋白衣壳可包载48个硒代半胱氨酸,包载率大约在81%。对其释放速率的研究证明硒代半胱氨酸可以被细胞内常见的还原剂还原型谷胱甘肽从AaLS-IC蛋白衣壳中释放,在48小时内可达到最大释放产率。之后我们也证明衣壳内半胱氨酸位置的重要性,设计了两种AaLS变体,AaLS-EC和五聚体形式的AaLS-IC,以不同的角度证明了外置半胱氨酸的蛋白衣壳不可形成单一的衣壳与客体分子的复合物,在反应过程中会有二聚体蛋白的产生。同时,我们也从细胞毒性与细胞摄取两个角度证明了AaLS-IC蛋白衣壳可将硒代半胱氨酸传递进入细胞中,并且可展现出硒代半胱氨酸的毒性,而细胞毒性与蛋白衣壳在细胞内定位之间的联系也激励我们进一步修饰蛋白衣壳的外表面,使其对特定靶细胞具有特异性,从而提高硒代半胱氨酸传递进入细胞的有效性与靶向性。对于具有广泛细胞毒性的小分子潜在药物来说,细胞摄取的特异性是其能否被用作治疗分子的重要因素。这些实验结果表明,AaLS-IC有潜力被发展为一类药物传递系统,以提高潜在药物分子的特定化学与生物特性。
【学位授予单位】：天津大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R943

【相似文献】