以AcrB为靶标的小分子抑制剂的设计、合成及逆转耐药活性研究

发布时间：2020-07-05 11:46

【摘要】：抗菌药物在防治细菌感染方面发挥着关键作用,也对器官移植、肿瘤化疗与放疗等新技术的成功应用起着保障作用。然而,细菌耐药性在全球范围内的广泛流行和传播,已对人类健康构成了严重威胁。特别是肠杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌等革兰阴性菌引起的感染,己导致临床上可选用的有效药物越来越少。更为严重的是,新世纪以来仅有少数几个新结构类型的抗菌药物在全球上市。鉴于此种形势,世界卫生组织(WHO)警告:在不远的将来,在治疗多药耐药革兰阴性菌引起的严重感染方面将面临无药可用的局面。因此,革兰阴性菌的多重耐药性以及耐药菌引起的感染已成为日益严重的全球性公共卫生问题,迫切需要研究全新作用机制的抗菌新药来应对细菌多重耐药性的挑战。AcrB是一种广泛存在于革兰氏阴性菌细胞膜上的转运蛋白,具有高度保守性,能将进入菌体的有害物质泵出体外。过度表达AcrB的细菌可将进入菌体内的各类药物分子不断泵出,使其浓度低于有效浓度,不足以抑制或杀灭细菌,从而导致细菌多药耐药表型的产生。如果AcrB的外排机制受到抑制或干扰,将会使得进入菌体内的药物分子不断积聚,从而恢复现有抗菌药物的杀菌效能。因此,AcrB是十分理想的抗菌药物新靶点。本论文以AcrB为靶标,以课题组前期发现的AcrB抑制剂NDGA和A3为先导物,根据靶点的结构性质,综合运用药物化学原理、计算机辅助药物设计和生物化学等手段,设计合成三大骨架结构共10个系列化合物。通过逆合成分析,确定了简洁高效的合成路线,并最终定向合成了 106个目标化合物,并通过多种谱图对目标化合物的结构进行了表征。在逆转耐药活性评价方面,我们首先测定目标化合物的固有抗菌活性,确定目标化合物与抗菌剂联合用药时的浓度范围,以排除联合用药时目标化合物本身对抗菌活性的影响。随后目标化合物与相应抗菌剂(氯霉素、红霉素、四苯基氯化膦和左氧氟沙星)联合应用测定目标化合物的抗菌增敏活性,然后选取抗菌增敏活性显著的化合物,通过尼罗红外排实验、DiOC2(3)荧光检测实验和头孢硝噻水解实验进一步测定了它们的外排抑制活性,以及对内膜质子梯度和外膜渗透性的影响,从而在细胞水平上确定它们的靶向性。邻苯二酚类AcrB抑制剂的研究。本论文第二章以前期发现的AcrB抑制剂NDGA的结构为基础,根据AcrB结合位点的具体性质,通过对右侧苯环和连接子的结构多样化修饰,设计合成了 WA、WB、WC和WD四个系列化合物,并对其进行了体外抗菌增敏活性研究。实验结果表明,化合物WA5、WA7、WB11、WD5和WD6表现出较好的抗菌增敏活性,尤其是化合物WD6,在低浓度下(8μg/mL),可提高氯霉素和红霉素对,E.coli BW25113的敏感性,使他们的活性提高2倍;随着浓度的升高(32 μg/mL),它的广谱性逐渐显现,对所有测试抗菌剂都显示出抗菌增敏活性;而当浓度达到128 μg/mL时,抗菌增敏活性进一步提高,可使氯霉素、红霉素、四苯基氯化膦和左氧氟沙星的抗菌活性分别提高4,4,4和4倍。与对照NDGA相比,这些化合物抗菌增敏活性显著改善。这些化合物的构效关系总结如下:(1)邻苯二酚类化合物的抗菌增敏活性与苯环上的取代基密切相关,亲水性基团为优势基团;(2)在侧链末端引入空间位阻较大的芳环结构如联苯、萘和蒽等不利于保持增敏活性;(3中间连接子以三原子链为最佳且在连接子中引入酰胺基团能够显著提高抗菌增敏活性。为了确认目标化合物的外排抑制活性,我们选取具有抗菌增敏活性的化合物测定了它们对底物尼罗红的外排抑制活性,并且选取各系列中具有代表性的化合物((WA5、WA7、WA9、WB11、WC1、WC2、WD5和WD6))进一步测定了它们对内膜质子梯度及外膜渗透性的影响,从而确定其靶向性。实验结果表明:化合物WA7、WA9、WA10、WB11、WC3和WC4在100 μM和200μ 浓度下能够完全抑制尼罗红的外排作用;化合物WA5、WA7、WA9、WB11和WC2在128和256 μg/mL浓度下不影响细胞外膜渗透性;化合物WA7、WD5和WD6(32 μg/mL)不影响内膜质子梯度。综上所述,化合物WA7和WD6是完全意义上的AcrB抑制剂,符合有效AcrB抑制剂的应具备的所有条件:(1)对AcrB过表达菌株能增强抗生素的抗菌活性;(2)对AcrB基因缺失菌株无抗菌增敏活性;(3)对AcrB底物尼罗红具有外排抑制活性;(4)不会破坏细菌外膜的渗透性;(5)不影响内膜质子梯度。2-萘甲酰胺类AcrB抑制剂的研究。基于AcrB结合口袋的出口区域存在一个充满极性氨基酸和水分子空腔的结构,以A3为先导化合物,通过在A3的C-4位侧链延伸结构多样性的极性基团,包括脂肪胺,含极性取代基的芳环和含氮杂环等,作为氢键受体或供体探索与周围氨基酸残基的相互作用以及空间体积的容纳性,共设计合成了 E和F两个系列共28个化合物。生物活性评价结果表明,化合物E3、E9、E10、F1、F7、F9和F10表现出一定的抗菌增敏活性,优于先导物A3。其中化合物E3和E10(128μg/mL)能够提高红霉素的抗菌活性,使其MIC值较单独使用时降低8倍。此外,化合物E9(256μg/mL)和E10(128μg/mL)能使氯霉素对野生型E.coli BW25113菌株的敏感性提高8和4倍。随后选取上述具有增敏活性的代表化合物分别测定了它们对尼罗红的外排抑制活性,以及对内膜质子梯度和外膜渗透性的影响。实验结果表明,所有化合物在不同浓度下均表现出一定程度的尼罗红外排抑制活性,其中化合物E10最为显著,在100 μM浓度下可以完全抑制尼罗红的外排;化合物E3、E9、F7和F9对外膜渗透性不会产生影响,而化合物E10、Fl和F10能够明显改变头孢硝噻吩的水解速率,并显著增加外膜的通透性;化合物E3、E9、E10、F7、F9和F10对内膜质子梯度没有影响,而化合物F1能够破坏内膜质子梯度,阻遏AcrB的能量来源。综上所述,化合物E3、E9和F7是完全意义上的AcrB抑制剂。苯并色烯类AcrB抑制剂的研究。在晶体研究和分子模拟研究的基础上,运用骨架跃迁及片段骈和的药物设计原理将2-萘甲酰胺类AcrB-抑制剂的有效药效团萘环与吡喃并吡啶环相结合得到了一类新颖的苯并[h]色烯母核结构。在此基础上,通过在母核C-5位上引入不同极性的基团以探讨与周围溶剂水分子及氨基酸残基之间的最佳作用力。同时侧链末端苯环上引入结构多样的基团以探讨它们的构效关系,共设计合成了 WI-WL四个系列的苯并[h]色烯类化合物。活性结果显示,在WJ系列化合物中,化合物WJ10表现出优于PAβN的抗菌增敏活性,在浓度为32 μg/mL时即可使氯霉素的MIC值降低2倍;在WK系列化合物中,大部分的化合物(WK1-WK7)都表现出明显的抗菌增敏活性,尤其是化合物WK2,它在低浓度下对所测试的所有抗菌剂(红霉素、氯霉素、四苯基氯化膦和左氧氟沙星)都表现出较好的增敏活性,具有一定的广谱特性;在WL系列化合物中,母核上具有吗啉甲酰基的化合物WL7和WL10抗菌增敏活性尤为突出,能够以浓度依赖性的方式(8～128 g/mL)提高相应抗菌剂的抗活性,使其MIC降低2～16倍。进一步分析WI-WL四个系列化合物的构效关系可知,在母核苯并[h]色烯母核C-5位上引入不同的取代基对抗菌增敏活性影响显著,如体积相对较小且与母核存在较强刚性连接的基团更有利于保持抗菌增敏活性;而右侧苯环上既可以引入体积较大的亲水性基团又可以引入体积较小的亲脂性基团。随后选取上述具有增敏活性的代表化合物分别测定了它们对尼罗红的外排抑制活性,以及对内膜质子梯度和外膜渗透性的影响。实验结果表明,化合物WL8和WL9对底物尼罗红的外排抑制活性最好,在50 μm的浓度下就可以完全抑制尼罗红的外排;除化合物WL1和WL2在128 μg/mL浓度下对对头孢噻吩的水解速率产生轻微影响之外,其他化合物(WK1-WK7和WL7-WL10)在128或256μg/mL浓度下并没有对细胞外膜渗透性产生影响;化合物WK1-WK7、WL2、WL7和WL8不会破坏内膜pmf。综上所述,本论文基于细菌AcrB蛋白复合物晶体的结构生物学信息,以课题组前期发现的AcrB抑制剂NDGA和A3为先导化合物,根据邻苯二酚类、2-萘甲酰胺类和苯并色烯类AcrB抑制剂各自的结合模式及药效团特征,利用骨架跃迁和片段骈和等经典药物原理设计合成了三大类共106个具有新颖骨架结构的化合物,并对这些化合物依次进行了固有抗菌活性、抗菌增敏活性、尼罗红外排抑制活性、对内膜质子梯度和外膜渗透性影响的测定,同时运用分子对接软件进行分子模拟以验证设计的合理性。利用得到的构效关系对化合物进行逐步的结够改造和优化,得到了一些具有高增敏活性和高选择性的AcrB抑制剂。尤其是化合物WA7和E9,表现出明显优于先导化合物NDGA和A3的抗菌增敏活性,可以完全抑制尼罗红的外排,抑制率达到100%,而且它们不会破坏内膜质子梯度和外膜渗透性,是完全意义上的AcrB抑制剂。另外,苯并[h]色烯类AcrB抑制剂是我们对此类抑制剂的首次发现,之前未见文献报道,尤其是化合物WK2、WL7和WL10等均表现出广谱、高效的抗菌增敏活性,明显优于对照化合物PAβN,这为新型AcrB抑制剂的发现提供了新的方向。该研究不仅得到了一些结构新颖且活性较好的先导化合物,而且进一步加深了我们对于AcrB蛋白空间结构的认识,为AcrB抑制剂的合理设计提供理论依据,为其研究与开发奠定基础,为多重耐药菌的感染治疗提供了一条新的思路。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R914
【图文】：

图.如吹】

本文编号：2742565