左卡尼汀对多西他赛抑制NCI-H520细胞增殖作用影响的研究

发布时间：2020-07-05 17:10

【摘要】：目的:探究心脏保护剂左卡尼汀(L-carnitine,L-CNT)对化疗药物多西他赛(Docetaxel,DTX)抑制肺癌细胞NCI-H520增殖作用的影响,并初步探索L-CNT影响DTX抗肿瘤作用的机制。方法:1.实验药物浓度的确定采用MTT法分别测定不同浓度的L-CNT和DTX在24小时对NCI-H520细胞增殖活性的影响,根据MTT的结果确定实验所采用的L-CNT和DTX的作用浓度。其中L-CNT的浓度范围为2.5、10、40、80μg·mL~(-1),DTX的浓度范围为0.25、2.5、5、10、25、50、100、200μg·mL~(-1)。2.L-CNT对DTX抑制NCI-H520细胞增殖的影响将NCI-H520细胞分为四组进行实验,分别为对照组(Control)、L-CNT组、DTX组以及联合用药组(L-CNT+DTX)。采用MTT法检测NCI-H520细胞增殖情况,倒置显微镜观察各组细胞形态学变化。3.L-CNT对DTX诱导NCI-H520细胞凋亡及细胞周期变化的影响采用Annexin V-FITC/PI双染法经流式细胞仪检测NCI-H520细胞凋亡情况,PI单染检测细胞周期。4.L-CNT影响DTX在NCI-H20细胞中抗肿瘤作用的机制研究。采用Western blot法检测细胞周期相关蛋白p21、p53以及细胞凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达。结果:1.确定L-CNT和DTX的实验浓度MTT的实验结果显示,L-CNT在2.5-80μg·mL~(-1)浓度范围内,对NCI-H520细胞的增殖无明显影响,各组间的细胞增殖率没有统计学差异。而DTX在0.25-200μg·mL~(-1)浓度范围内,对NCI-H520细胞增殖的抑制表现出明显的浓度依赖性,且随浓度的增加,抑制作用增强。DTX在24h的IC_(50)值为40μg·mL~(-1)。结合临床患者L-CNT用药剂量,确定L-CNT和DTX的实验浓度分别为80μg·mL~(-1)和40μg·mL~(-1),实验时间为24h。2.L-CNT能够增强DTX对NCI-H520细胞增殖的抑制作用倒置显微镜下观察结果显示,Control组和L-CNT(80μg·mL~(-1))组的细胞间连接紧密,细胞轮廓清晰饱满,两组无明显差别,DTX(40μg·mL~(-1))组细胞出现皱缩、胞质空泡化,细胞间隙变大,L-CNT(80μg·mL~(-1))+DTX(40μg·mL~(-1))组细胞间隙进一步增加,细胞数量减少。MTT结果显示,Control组和L-CNT(80μg·mL~(-1))组的增殖率无明显变化。与DTX(40μg·mL~(-1))组相比,L-CNT(80μg·mL~(-1))+DTX(40μg·mL~(-1))组的增殖率由65.73±2.22%下降到54.4±1.67%(P0.05)。3.L-CNT通过调节细胞周期增强DTX对NCI-H520细胞增殖的抑制作用细胞凋亡的实验结果显示,在24h,与Control组相比,L-CNT(80μg·mL~(-1))组、DTX(40μg·mL~(-1))组和L-CNT(80μg·mL~(-1))+DTX(40μg·mL~(-1))组的凋亡率没有发生明显变化。细胞周期的实验结果显示,与Control组相比,L-CNT(80μg·mL~(-1))组细胞周期没有发生明显变化。DTX(40μg·mL~(-1))组细胞发生明显的G2/M期阻滞,G0/G1期细胞比例由70.23±4.5%降低至11.52±0.89%,G2/M期细胞由11.11±2.48%升高至54.91±2.38%,差异均具有统计学意义(P0.001)。与DTX(40μg·mL~(-1))组相比,L-CNT(80μg·mL~(-1))+DTX(40μg·mL~(-1))组G0/G1期细胞比例由11.52±0.89%降低至3.98±0.42%,G2/M期细胞比例由54.91±2.38%升高至64.56±0.9%,差异具有统计学意义(P0.05)。4.L-CNT能够增高周期相关蛋白的表达与Control组相比,L-CNT(80μg·mL~(-1))组p21、p53、Bax和Bcl-2在蛋白水平的表达上均无明显差异;DTX(40μg·mL-1)组细胞的周期相关蛋白p21和p53在蛋白的表达水平上有显著升高,差异具有统计学意义(P0.05),凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2无明显变化。与DTX(40μg·mL-1)组相比,L-CNT(80μg·mL~(-1))+DTX(40μg·mL~(-1))组在周期相关蛋白p21和p53的表达上进一步升高,差异具有统计学意义(P0.05),凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达并未表现出明显变化。结论:1.L-CNT(80μg·mL~(-1))在24h对NCI-H520细胞的增殖无明显抑制作用,也不会诱导细胞发生凋亡。2.DTX(40μg·mL~(-1))在24h能够抑制NCI-H520细胞的增殖,主要通过诱导细胞发生G2/M期阻滞来发挥作用,DTX(40μg·mL~(-1))在24h不会诱导细胞发生凋亡。3.L-CNT(80μg·mL~(-1))在24h能够增强DTX(40μg·mL~(-1))对NCI-H520细胞增殖的抑制作用,其机制可能是通过上调p21和p53在蛋白水平的表达,促进细胞发生G2/M期周期阻滞来发挥作用。4.DTX(40μg·mL~(-1))在24h对NCI-H520细胞只表现为增殖的抑制作用,而不诱导凋亡。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R96
【图文】：

细胞增殖

****** P<0.001 VS Control图1.1 不同浓度的DTX作用24h对NCI-H5220细胞增殖的影响（。mean±SD,n=3）*** P<0.001 VS Control1.2.2 不同浓度的 L-CNT 对 NCI-H520 细胞增殖的影响

细胞增殖,抑制作用,浓度,对照组

40 95.36±2.5980 98.75±2.15图1.2 不同浓度的L-CNT作用24h对NCI-H5220细胞增殖的影响（mean±SD,n=3）1.3 小结1. MTT 实验结果显示，在 0.25-200 μg·mL-1的浓度范围内，DTX 对 NCI-H520细胞的增殖均产生抑制作用，并且抑制作用随浓度升高而增强，本实验选择 DTX的浓度为 40 μg·mL-1（IC50）。2. 2.5-80 μg·mL-1浓度范围内，L-CNT 对细胞增殖作用不明显，且同对照组

【参考文献】