乌司他丁对氧化应激损伤海马神经元线粒体膜电位及凋亡相关蛋白BCL-2、MCU的影响

发布时间：2020-07-06 05:52

【摘要】：目的:探讨乌司他丁对氧化损伤海马神经元线粒体能量代谢、膜电位变化,以及凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤/白血病-2蛋白(BCL-2)、线粒体钙单向转运蛋白(MCU)的影响和可能的机制。方法:分离SD胎鼠海马,采用无血清培养原代海马神经元,取培养至第9天的神经元,采用H2O2建立氧化应激损伤模型,分为空白对照组(N),H2O2组(H),乌司他丁预处理1000u/ml+H2O2组(UTI1+H),乌司他丁预处理2000u/ml+H2O2组(UTI2+H),倒置相差显微镜观察神经元形态的改变,酶标仪检测神经元的Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性;荧光显微镜观察JC-1法检测线粒体膜电位变化;Annexin-V-Fluorescein/PI双染法和Hoechst33342/PI双染法测神经元凋亡率;采用RT-PCR及Western-blot检测BCL-2、MCU蛋白的表达。结果:1、采用无血清培养原代海马神经元生长良好,培养8-14天的神经元长势最好,细胞核立体感强,轴突联接成网络,神经元纯度为92.05%,满足实验要求。2、各组形态改变,H组可见神经元胞浆浓缩,细胞核边集,胞间隙增大,轴突断裂,少部分细胞悬浮。UTI1+H和UTI2+H组可见细胞保持完整形态,部份细胞皱缩,胞体有光晕。3、ATP酶的测定:与N组比较,H组Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性降低(P0.05),与H组比较,UTI1+H和UTI2+H组Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性升高(P0.05),UTI1+H和UTI2+H组间差异具有统计学意义(P0.05)。4、对细胞凋亡相关指标的影响:与N组比较,H组线粒体膜电位降低、凋亡率升高(P0.05),与H组比较,UTI1+H和UTI2+H组线粒体膜电位升高、凋亡率降低(P0.05),UTI1+H和UTI2+H组间差异具有统计学意义(P0.05)。5、BCL-2、MCU的表达:与N组比较,H组BCL-2蛋白表达降低,MCU蛋白表达增加(P0.05),与H组比较,UTI1+H和UTI2+H组BCL-2蛋白表达增加,MCU表达降低(P0.05),UTI1+H和UTI2+H组间BCL-2表达差异具有统计学意义(P0.05),MCU表达差异无统计学意义(P0.05)。结论:1、氧化应激损伤的神经元可导致能量代谢障碍、线粒体膜电势能降低、细胞凋亡等病理改变。2、经过浓度为1000U/ml、2000U/ml乌司他丁预处理可以抑制H2O2诱导的海马神经元细胞氧化应激损伤,这可能与其维持细胞能量代谢、稳定线粒体膜电位,升高BCL-2表达,降低MCU表达,从而降低细胞凋亡率有关。
【学位授予单位】：西南医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R96
【图文】：

胎鼠,孕鼠,体视显微镜,形态变化

9 SD 大鼠孕鼠剖腹取出胎鼠 B：胎鼠 C：体视显微镜下未分离海马组织 D图 1 胎鼠海马组织Fig.1 Hippocampus of prenatal rat光学显微镜下海马神经元的形态变化观察(图 2)

海马神经元,光学显微镜,胞体,突触

注 A：Day1 细胞基本贴壁，胞体透亮，周围有光晕可见短小突触（×100）； B：Day5 细胞伸出突触，胞体立体感强（×100）；C:Day8 神经元突触较长，胞体形圆（×100）；D：Day10 神经元交织成网络（×100）；E:Day16 神经元突起交织成网络，胞体相对变小，光晕减弱（×100）；F：Day20神经元折光性弱，细胞变形，突起连续性差，部分细胞开始裂解（×100）图 2 光学显微镜下不同时间点海马神经元的形态观察

免疫荧光,海马神经元,神经元,蓝色荧光

- 29 -注 A：Day8 神经元免疫荧光，细胞核 DAPI 标记蓝色荧光（×200）；B：Day8 神经元，免疫荧光β-Ⅲ Tublin 标记胞浆和突触绿色荧光（×200）；C：merged。图 3 海马神经元免疫荧光鉴定Fig.3 immune fluorescent identification of hippocampal neurons

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