抗乙肝临床药物GLS4前药及“Me-too”药物的设计、合成及其活性研究

发布时间：2020-07-07 17:48

【摘要】：乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)是一种嗜肝DNA病毒,可通过血液、母婴、性接触和皮肤黏膜破损等途径传播,长期感染可引发慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)、肝代谢失常、肝硬化(liver cirrhosis,LC)和肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)等疾病。根据世界卫生组织(World Health Organization,WHO)的相关统计,全球大概有2.6亿慢性乙肝患者,主要分布在亚洲和非洲等地区,我国是乙肝高发国,慢性乙肝患者约两千万人。乙肝发病率高,病程长,目前已上市的核苷(酸)类抗HBV小分子药物无法治愈乙肝。因此,研发安全高效的非核苷类HBV抑制剂具有重要意义。随着结构生物学的发展,HBV生命周期中多个靶点近年来被相继报道。其中,HBV核衣壳蛋白在整个生命周期中起着重要作用,包括参与前基因组RNA的逆转录,自由环状DNA的合成和亚病毒颗粒的形成。核衣壳蛋白抑制剂可以通过干扰核衣壳的正常装配、诱导形成不规则的多聚物、促进核心蛋白的降解或促进不含病毒基因的“空壳”的形成等机制来抑制HBV的复制。该类抑制剂对于野生株和突变株均有较好的抑制活性,并能与核苷类药物发挥协同抗病毒作用,是目前研究最多的非核苷类小分子抑制剂。二氢嘧啶(Heteroaryldihydropyrimidin,HAP)类HBV核衣壳蛋白抑制剂GLS4具有较好的抗病毒活性,其抑制HBV DNA复制活性已达到纳摩尔级别(HepG2.2.15细胞系,IC50= 12 nM),对阿德福韦耐药株也有较好的活性(rtA181V,IC50= 0.161 μM;rtN236T,IC50= 0.131 μM),目前正由广东东阳光药业有限公司进行Ⅱ期临床研究。但是,GLS4的水溶性较差,口服生物利用度不高(cLogP=4.7,F=14%),限制了其临床应用。针对以上问题,本论文第二章采用前药修饰策略,将优势基团“5-甲基-2-氧代-1,3-二氧杂环戊烯”引入到二氢嘧啶母环1位氮原子上,设计合成了 GLS4的前药 Ⅰ-5,并对其进行了体外细胞活性(细胞毒性、抑制HBV DNA复制活性和抑制抗原分泌活性)、水溶性、急性毒性和药代动力学测定。实验结果表明:Ⅰ-5的细胞毒性较低(CC5050μM),抑制HBV DNA复制活性较高(IC50为0.041 ±0.045 μM),与GLS4相当(IC50=0.035±0.025 μM),是上市药物拉米夫定的40多倍(IC50= 1.73±0.28μM);另外,Ⅰ-5表现了一定的抑制HBsAg和HBeAg抗原分泌的活性,其IC50分别为17.87±0.8 μM和0.39±0.1 μM,与先导化合物GLS4 水平相当(IC50分别为 15.82±0.4μM和0.18±0.03 μM),且远高于拉米夫定 IC5050μM)。除此之外,Ⅰ-5在pH为7.4的PBS缓冲液中的溶解度(15.13 μg/mL)远远高于相同条件下GLS4的溶解度(0.32 μg/mL);按最大剂量2 g/kg对小鼠灌胃时,Ⅰ-5表现出较低的急性毒性;但是1-5在体内极不稳定,代谢成其他产物,药代动力学性质较差,无法释放足够浓度的活性原药。本论文第三章根据课题组前期对二氢嘧啶类HBV核衣壳蛋白抑制剂构效关系的探讨,基于核衣壳蛋白晶体复合物结构生物学研究,靶向蛋白溶剂界面运用基于晶体结构的分子杂合策略及生物电子等排原理进行二氢嘧啶类抑制剂的结构修饰,共设计合成了两类结构新颖的二氢嘧啶-磺酰胺和二氢嘧啶-磷酰胺衍生物,并进行了体外细胞毒性、抑制HBV DNA复制活性和抑制抗原分泌活性测试及分子模拟研究。实验结果表明:磺酰胺系列的R1基团中,硝基的取代有利于提高活性,但取代基的位置对活性影响很大,邻位和对位活性较好,间位取代导致活性的丧失;磷酰胺的R2基团中,苄基的取代活性最好,引入氟原子有助于进一步提高活性,但较大的取代基导致毒性变大。其中,化合物Ⅱ-6m的细胞毒性较小(CC5050 μM),抑制HBV DNA复制的活性(IC50=0.76±0.12 μM)达到了上市药物拉米夫定(IC50=0.62±0.31 μM)的水平,还表现出一定的抑制e抗原分泌活性(IC50=18.12±7.9 μM)。分子模拟结果显示Ⅱ-6m的磺酰胺基团与核心蛋白的Leu140主链形成氢键作用力,验证了设计思路。Ⅱ-6m可作为先导化合物供进一步修饰。综上,本论文根据二氢嘧啶类抗乙肝临床药物GLS4的结构特征、已知构效关系和核衣壳蛋白晶体复合物结构,分别运用前药、基于晶体结构的分子杂合和生物电子等排原理的设计策略,并经体外抗HBV活性筛选发现了结构新颖的“5-甲基-2-氧代-1,3-二氧杂环戊烯”类GLS4前药、二氢嘧啶-磺酰胺和二氢嘧啶-磷酰胺衍生物共三类活性分子,具有进一步开发的前景;探讨了目标化合物的构效关系和代表性化合物的结合模式,为该类药物的深入研究奠定了基础。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R914;R96
【图文】：

乙肝病毒颗粒

第一节乙肝病毒及其结构特点逡逑ＨＢＶ是一种嗜肝性（ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）的ＤＮＡ病毒，包括大球形颗粒、小逡逑球形颗粒和管形颗粒三种形态（图１－１），其中，大球形颗粒又称Ｄａｎｅ颗粒，逡逑直径大约为４２邋ｎｍ，携带ＨＢＶ遗传物质，具有感染性｜５］。完整的大球形颗粒外逡逑层是磷脂双分子层，脂膜上镶嵌着大、中、小三种包膜蛋白，即乙肝病毒表面抗逡逑原（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ邋Ｂ邋ｓｕｒｆａｃｅ邋ａｎｔｉｇｅｎ，ＨＢｓＡｇ）；内层是一个正二十面体的核壳体，由逡逑核心抗原（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ邋Ｂ邋ｃｏｒｅ邋ａｎｔｉｇｅｎ，邋ＨＢｃＡｇ）聚集形成，ＨＢｃＡｇ邋含有邋１８３－１８５邋个逡逑氨基酸残基，分为衣壳装配域和核酸结合域［Ｍ］。核心蛋Ａ通常以二聚体的形式逡逑存在，单体之间通过６］位的半胱氨酸残基（Ｃｙｓ－６１）以二硫键保持稳定性；三逡逑个二聚体再通过疏水作用力结合变成六聚体，六聚体进一步组装得到完整且稳定逡逑的核衣壳。９０或１２０个二聚体组装成两种核心蛋白颗粒（Ｔ邋＝邋３或４）邋

基因组结构

图１－２邋ＨＢＶ基因组结构［１４］逡逑第二节乙肝病毒的生命周期逡逑如图１－３所示，ＨＢＶ完整的生命周期包括：侵入、脱壳、遗传物质的－放、逡逑ｃｃｃＤＮＡ的合成、转录、翻译、核壳体的包装、逆转录、ＤＮＡ复制、表面蛋白逡逑包裹修饰、分泌出胞等步骤［１４—１７］。逡逑ＨＢＶ感染宿主后，经血液循环浓集于肝脏附近，病毒颗粒与肝细胞表面的逡逑硫酸乙酰肝素蛋白聚糖受体（ｈｅｐａｒａｎ邋ｓｕｌｆａｔｅ邋ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ，邋ＨＳＰＧ）特异性结合逡逑［１８］，接着病毒表面蛋白的ＰｒｅＳｌ区与牛横胆酸钠协同转运多肽（ｓｏｄｉｕｍ逡逑ｔａｕｒｏｃｈｏｌａｔｅ邋ｃｏｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ邋ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ，ＮＴＣＰ）相互作用［１９］，病毒颗粒随之被摄逡逑取进入胞内。此时核壳体裂解，释放ｒｃＤＮＡ，ｒｃＤＮＡ穿过核孔进入细胞核［２°］。逡逑在宿主聚合酶的作用下，以负链为模板修补正链得到共价闭合环状ＤＮＡ逡逑（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ邋ｃｌｏｓｅｄ邋ｃｉｒｃｕｌａｒ邋ＤＮＡ，ｃｃｃＤＮＡ）邋［２１］。以邋ｃｃｃＤＮＡ邋为模板，病毒利用逡逑宿主细胞的ＲＮＡ聚合酶转录合成四种长度的ＲＮＡ邋（３．５邋ｋｂ、２．４邋ｋｂ、２．１邋ｋｂ和０．７逡逑ｋｂ）

乙肝病毒,生命周期

逡逑图１－２邋ＨＢＶ基因组结构［１４］逡逑第二节乙肝病毒的生命周期逡逑如图１－３所示，ＨＢＶ完整的生命周期包括：侵入、脱壳、遗传物质的－放、逡逑ｃｃｃＤＮＡ的合成、转录、翻译、核壳体的包装、逆转录、ＤＮＡ复制、表面蛋白逡逑包裹修饰、分泌出胞等步骤［１４—１７］。逡逑ＨＢＶ感染宿主后，经血液循环浓集于肝脏附近，病毒颗粒与肝细胞表面的逡逑硫酸乙酰肝素蛋白聚糖受体（ｈｅｐａｒａｎ邋ｓｕｌｆａｔｅ邋ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ，邋ＨＳＰＧ）特异性结合逡逑［１８］，接着病毒表面蛋白的ＰｒｅＳｌ区与牛横胆酸钠协同转运多肽（ｓｏｄｉｕｍ逡逑ｔａｕｒｏｃｈｏｌａｔｅ邋ｃｏｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ邋ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ，ＮＴＣＰ）相互作用［１９］，病毒颗粒随之被摄逡逑取进入胞内。此时核壳体裂解，释放ｒｃＤＮＡ，ｒｃＤＮＡ穿过核孔进入细胞核［２°］。逡逑在宿主聚合酶的作用下，以负链为模板修补正链得到共价闭合环状ＤＮＡ逡逑（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ邋ｃｌｏｓｅｄ邋ｃｉｒｃｕｌａｒ邋ＤＮＡ

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