多孔修饰的离子响应型蛋白药物靶向给药体系的构建及其体内外评价

发布时间：2020-07-10 13:26

【摘要】：干扰素(interferon,IFN)是一种具有广谱抗肿瘤、抗病毒活性和免疫增强功能的糖蛋白类细胞因子,是目前临床上最主要的抗肿瘤生物制品之一。重组人干扰素ɑ-2b(Recombinant human interferonɑ-2b,rhIFNɑ-2b)与天然人IFNɑ-2b具有相同的生物学活性,可与其他药物联用持续治疗小细胞或非小细胞肺癌。与多数蛋白大分子药物一样,rh IFNɑ-2b在体内半衰期短,药理活性不专一,且制剂的制备条件和释放环境显著影响其稳定性,使其广泛应用受限。本文基于离子交换和静电自组装技术,制备了高包封率、并负载高活性rhIFNɑ-2b的壳聚糖-羧甲基壳聚糖微球(CS-rh IFNɑ-2b-CMCS-MS),微球具有缓释效果,并被动靶向至肺。该药物传递系统可广泛应用于蛋白多肽类药物。全文共分为以下五部分:一、综述本章首先简要综述了蛋白大分子模型药物-干扰素的理化性质、抗肺癌活性及制剂开发方向;其次,概述了目前蛋白多肽类药物可生物降解微球的常用载体、制备方法以及应用过程普遍存在的问题;最后,综述了羧甲基壳聚糖(Carboxymethyl Chitosan,CMCS)离子交换基质在生物大分子传递系统中的应用和机理。二、空白羧甲基壳聚糖多孔微球的制备及表征本章采用乳化交联法制备空白羧甲基壳聚糖多孔微球(CMCS-MS),以微球的形貌粒径、孔隙率为指标,分别筛选CMCS溶液的浓度、水油相比例、乳化剂用量、致孔剂用量、交联剂用量、乳化搅拌速度等影响因素,优化处方工艺。最终确定微球制备工艺为:2%CMCS、水油相比1:8、吐温-80用量为水相体积的2%、司盘80用量为油相体积的2%、乙酸乙酯与水相体积比2:5、交联剂与水相质量比1:5、乳化搅拌速度900 rpm、乳化1h、固化3 h,反应结束后正己烷、无水乙醇、去离子水充分洗涤,冻干即得浅黄色粉状微球。扫描电镜(SEM)表征微球的形貌,空白微球外观圆整,多孔隙,最大孔径200~300 nm。75%以上微球粒径分布在5~15μm,易被肺部毛细血管截留。傅里叶红外光谱(FTIR)证明交联微球的形成。微球孔隙率(30.28±1.14)%、离子交换容量(9.97±0.07)mmol/g,且在各溶液中均呈负电位,证明其具有较好的吸引和容纳正电荷药物的能力。此外,用电位滴定曲线阐明了微球上可交换基团(羧基)的解离行为,确定微球的离子交换最佳pH为4.3以上。微球具有pH和离子响应性,在pH7.4人体液模拟环境和0.9%生理盐水中溶胀明显快于pH1.2胃液模拟环境。微球体外降解能力、热稳定性良好。MTT试验评价空白微球细胞毒性,微球生物相容性良好。三、载牛血清白蛋白-羧甲基壳聚糖微球的制备本章建立了微球包封率及载药量、体外释放测定方法,采用考马斯亮蓝法测定蛋白药物含量,并进行方法学验证。采用离子交换动态载药法,以牛血清白蛋白(Bovine albumin,BSA)为大分子模型药物,载药量为评价指标,固定离子交换柱穿透率为0.1,单因素试验筛选出合适的缓冲液种类、溶液pH、离子强度、药物浓度、反应温度、柱子横截面积、溶液流速等,制得高活性和高包封率的载牛血清白蛋白-羧甲基壳聚糖微球(BSA-CMCS-MS),为后面微球荷载rhIFNα-2b奠定基础。最终确定制备工艺为:动态玻璃交换柱(Ф16 mm×20cm),柱高径比7:1,室温25±0.5℃,5 mg/mL BSA溶液(0.02 mol/L pH4.6 HAc-NaAc),流速0.2 m L·min~(-1),12.5分钟时停止载药,用少量去离子水洗去微球表面未结合药物,待溶液流尽后,将微球取出冻干即可。在湿态微球表面自组装一层壳聚糖(Chitosan,CS)膜得自组装微囊(CS-BSA-CMCS-MS),微球包封率(84.39±6.19)%,初始释放进一步减小。差示扫描量热谱图(DSC)和微球体外释药结果验证BSA与微球主要以离子键结合。自组装后微球释药机制由离子交换释放(粒扩散)转变为一级释放(膜扩散),体外24小时累计释放86.78%。圆二色光谱(CD)和SDS-PAGE电泳结果显示,BSA二级结构和纯度在载/释药前后无明显变化。四、载干扰素-羧甲基壳聚糖微球的制备采用第四章动态载药处方工艺优化得出的工艺参数,以动态法制备rhIFNɑ-2b离子交换微球,并固定离子交换柱穿透率为0.1,考察溶液pH对载药量的影响。进一步自组装制备符合微囊(CS-rh IFNα-2b-CMCS-MS),微球包封率(89.91±0.38)%,体外24小时累计释放度83.89%,且无突释。CD和SDS-PAGE电泳结果显示,rhIFNα-2b的二级结构和纯度在载/释药前后无明显变化。细胞水平上的抗肺癌生物学活性研究表明,相同浓度的载药微球释放液保留了原液对A549细胞91.98%以上的抗增殖活性,初步证明该方法较好地保持了rhIFNα-2b在制备和释放过程中的生物学活性。五、小鼠体内药动学及组织分布研究本章建立了双抗体一步夹心法酶联免疫法(ELISA)测定小鼠血浆及组织rhIFNα-2b浓度,并进行方法学验证。药代动力学研究结果表明,尾静脉注射rhIFNα-2b原液和微球混悬液后,微球组较原液组有明显的缓释作用,微球达峰时间延后至1.5 h,半衰期9.039 h,平均滞留时间11.997 h,显著长于原液组。组织分布试验证明,载药微球能浓集于肺部,提高肺部rhIFNα-2b峰浓度(为溶液组的1.85倍),相比原液具有显著肺靶向效果。
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R943
【图文】：

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图 1.2 羧甲基壳聚糖多孔微球制备工艺流程图. 2 Preparation process of carboxymethyl chitosan porous micro聚糖离子交换基质的研究进展聚糖概述（carboxymethylchitosans,CMCS）是壳聚糖的羧甲基同，可以分为 O-羧甲基壳聚糖（O-CMCS），N-羧甲基（NO-CMCS），N,N-羧甲基壳聚糖（NN-CMCS）[46水溶性、生物相容性、可生物降解、低毒、可缓释、。近年来，CMCS 被广泛应用于生物医药[47-49]、组织保健品等多种领域。特别是其作为各种生物活性物传递系统领域的应用得到了越来越广泛的关注。

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图 1.4 羧甲基壳聚糖离子交换微球载药和释药机理re1.4 Mechanism of drug loading and release of CMCS-MS ion exchange m性条件下，环境 pH 小于 rhIFNα-2b 等电点，rhIFNα-2b 带正电聚糖微球离子结合。采用动态载药法，当流出液检测到药物时率理论可达 100%。而在人体生理环境下，体内的正离子（如α-2b 置换释放出来，从而发挥其生物学作用。据类药物因其高活性、高特异性、低毒性、生物功能明确等优势来源。但很多因素显著影响蛋白药物稳定性。利用壳聚糖及其术制备蛋白多肽类药物可生物降解缓释微球一直是药学领域研研究意义在于：首先，羧甲基壳聚糖是一种具有一定缓释效果

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壳聚糖及其衍生物微球的制备方法很多，但为尽可能保留微球上的羧基，进行后续的药物离子交换载药，本试验需避免选择损失大量羧基结合位点的制备方法，因此较合适的固化方法是氨醛反应，交联后微球上氨基含量大量减少，从而使得羧基能够更好的发挥其离子交换正电荷药物的能力。该法产率高、制得的微球稳定性好，为后期动态载药影响因素考察提供了充足的质量合格的微球储备。本课题使用少量低浓度戊二醛为交联剂，乳化交联法进行空白微球的制备。致孔原理：将乙酸乙酯加入到含有乳化剂的水相中，形成 O/W 型乳液。然后将该 O/W型乳液转移入油相中，进一步乳化形成 O/W/O 型三相乳液，交联固化后形成微球。整个过程乙酸乙酯不参与反应，收集微球时，用乙醇提取微球，去离子水洗，即可除去微球内的致孔剂。微球内部的水份在冻干过程中形成冰晶，不断升华，从而形成微球内部和表面的孔道。由此，制得了羧甲基壳聚糖多孔微球。2.3.1.2 羧甲基壳聚糖溶液浓度的影响

【参考文献】