氧化石墨烯损害自噬流和溶酶体功能诱导PC12细胞系发生p62蛋白依赖性凋亡的机制研究

发布时间：2020-07-10 23:18

【摘要】：研究背景近年来,氧化石墨稀(Graphene oxide,GO)在生物医学领域被广泛应用于肿瘤靶向治疗、细胞成像、组织工程及抗菌、杀菌等方面。应用范围的扩大同时导致GO对人体的暴露风险剧增。越来越多的研究报道纳米材料能够穿透血脑屏障或经神经摄取进入脑组织,产生潜在危害,因此评估GO对神经系统的生物安全性至关重要。纳米材料被发现是一种新型的自噬激活剂。生理状态下自噬有利于细胞内稳态的维持,当自噬启动异常,或者出现功能障碍时,会对细胞产生有害影响,甚至引发细胞程序性死亡。本研究采用慢病毒及干扰RNA转染技术、免疫荧光染色、流式细胞术及WB等检测手段,深入探讨GO对PC12神经细胞的毒性变现及作用机制。研究目的1.探讨自噬效应在GO神经毒表现中的重要作用。2.探讨溶酶体功能障碍和自噬流紊乱之间的关联。3.探讨自噬底物p62过度积累和细胞凋亡的相互关系。材料与方法1.材料表征扫描电子显微镜和原子力显微镜检测GO的初始粒径,红外光谱和拉曼光谱检测分子结构,X射线光电子能谱检测化学键和元素含量,动态光散射仪检测粒径分布和电位值。2.GO对细胞的增殖毒性及胞内摄取情况的研究:将细胞和GO共培养,采用细胞增殖毒性试剂盒及乳酸脱氢酶试剂盒测试细胞活力。细胞黏附及摄取研究:将FITC-BSA和GO等体积混合,孵育过夜,制备荧光标记GO。将细胞和荧光标记GO共培养,鬼笔环肽和DAPI染色,显微镜及流式检测荧光强度。此外,正常GO处理细胞24 h,戊二醛固定,SEM观察GO黏附情况。3.GO诱导自噬效应及相关信号通路的研究将细胞和GO共培养24 h后戊二醛固定,TEM观察自噬体。将慢病毒转染细胞和GO共培养,设置雷帕霉素阳性对照,观察自噬荧光点。将正常细胞和GO共培养,设置740-YP、SC79和3BDO激动剂处理组,Western blot(WB)检测自噬蛋白及相关信号通路的表达水平。4.GO损害溶酶体功能诱导自噬流阻滞将细胞和GO共培养,溶酶体示踪剂孵育,显微镜和流式细胞仪检测荧光强度。此外,用按照说明书检测酸性磷酸酶及组织蛋白酶B的活力值。最后,采用抗galectin-3和抗LAMP-1抗体孵育细胞,显微镜观察。5.p62蛋白积累导致细胞凋亡及相关信号通路的研究凋亡观察:将细胞和GO共孵育24 h,采用Annexin V-FITC/PI及LDH试剂盒测试。此外,设置CCCP 阳性对照,Hoechst染色后观察细胞核。最后采用WB检测凋亡相关蛋白的表达水平。p62蛋白回复检测:雷帕霉素和GO共处理细胞,采用LDH及Annexin V-FITC/PI试剂盒检测凋亡发生,WB检测凋亡相关蛋白的表达。siRNA-p62转染细胞后和GO共培养,WB检测凋亡蛋白的表达。统计分析采用Graphpad Prism(Graphpad,CA,USA)软件对数据进行统计学分析,测定结果以x±s表示。不同组间数据的比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)或独立样本t检验(Student's t test)。假设检验为双侧检验,检验水准a=0.05。结果1.GO呈薄片层状,厚度在1.0 nm左右。其特征性波峰为Dband和Gband,功能化学键包括C-O键、C=O键、C=C键及O-C=O键。GO在水溶液中,粒径分布在797.42 nm左右,Zeta电位是-47.9± 0.79 mV。在细胞培养基中,粒径为439.14±17.25 nm,Zeta电位是-9.82±1.06 mV。2.随着孵育时间的延长和材料浓度增加,GO对细胞的毒性作用逐渐增大。3.细胞对GO的摄取随时间延长而增加。GO进入细胞后,胞浆中出现大量自噬体。慢病毒转染细胞后,胞浆内出现大量的自噬荧光点。与阳性组相比,实验组自噬荧光点的红、绿色荧光比值明显下降。WB发现Atg5、p62及LC3 Ⅱ/Ⅰ均明显上升。通路蛋白PI3K、p-Akt和p-mTOR表达明显下降。4.随着GO浓度增大,溶酶体腔的pH值上升。同时,组织蛋白酶B和酸性磷酸酶的活力明显下降。溶酶体膜通透性也明显增加。5.Annexin-FITC/PI双染色发现,GO引起细胞凋亡。同样,JC-1检测发现细胞内红、绿荧光比值明显下降。此外,细胞核形态不规则,染色质深染。WB发现促凋亡蛋白表达上调,抗凋亡蛋白表达下调。雷帕霉素共处理后,细胞活力恢复,细胞凋亡率下降。此外,WB观察到自噬蛋白p62下调,促凋亡蛋白表达下调,而抗凋亡蛋白表达上调。采用siRNA敲低细胞内p62表达水平,出现类似效果。结论1.GO和PC12细胞共培养会产生浓度依赖性和时间依赖性的毒理作用。2.GO通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路激活自噬上游。同时,干扰溶酶体酸性pH值和正常膜通透性,导致溶酶体降解功能下降,引起自噬流下游紊乱,出现自噬底物p62蛋白的异常积累。3.p62蛋白上调会导致细胞凋亡,采用化学试剂或基因干扰降低p62的表达能够缓解凋亡发生。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R99

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本文编号：2749586