光致敏体外评价方法验证研究

发布时间：2020-07-10 23:27

【摘要】：研究背景光致敏属于严重的皮肤毒性作用,是化合物在光照条件下所引起的一种特殊皮肤过敏反应。临床表现为皮肤曝光部位出现红斑、丘疹、水疱等改变,伴有瘙痒或灼痛感,严重者会引起全身症状。光致敏性评价是皮肤用药、某些系统给药药物和化妆品安全评价中的重要项目,FDA、ICH和NMPA的相关指导原则中都要求对具有潜在光致敏作用的化合物进行评价。目前国内外公认的光致敏评价方法只有豚鼠光致敏试验,但该方法应用动物数较多,试验周期长,对动物造成的损伤较大,不符合动物福利原则,并且该方法缺乏客观定量的评价指标。另外,多个国家和地区已经全面禁止化妆品动物试验,并禁止新近做过动物试验的化妆品上市销售。因此亟需开发化合物光致敏体外评价方法。研究目的本研究的目的是完善已建立的THP-1细胞光致敏体外评价方法,确定光致敏具体评价指标和判定标准,并对建立的方法进行准确性、特异性、灵敏度和重复性的验证。研究方法1、以细胞表面标志物为评价指标的光致敏体外评价方法的验证将THP-1细胞分别与19种光致敏剂、4种光刺激剂、2种皮肤致敏剂、1种皮肤刺激剂及1种阴性受试物在细胞培养箱孵育24 h,每种受试物3-4个孵育浓度(皮肤刺激剂和阴性化合物为一个浓度),之后进行UVA照射或避光处理,照射强度为1.7 mw/cm2,照射或避光处理时间为50 min。UVA照射后将细胞换液,加入细胞培养基,放入培养箱继续培养24 h,然后用流式细胞仪测定THP-1细胞表面生物标志物CD54和CD86的表达水平。用碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色测定活细胞百分比,在保证细胞活率大于75%的基础上进行CD54和CD86检测。检测照射组和未照射组表达CD54、CD86的阳性细胞百分比及平均荧光强度(mean fluorescence intensity,MFI),并计算CD54和CD86的相对荧光强度(relative fluorescence intensity,RFI)。(1)在未照射条件下:RFI= 受试物非照射组“抗CD54或CD86抗体”MFI-本组同型对照MFI/细胞对照非照射组“抗CD54或CD86抗体”MFI-本组同型对照MFI(2)在照射条件下:RFI=(受试物照射组“抗CD54或CD86抗体”MFI-本组同型对照MFI)/(细胞对照照射组“抗CD54或CD86抗体”MFI-本组同型对照MFI)对于具有光刺激性的4种受试物及部分光致敏剂额外增加预照射处理试验组,即先将受试物加入细胞培养基内(无细胞),UVA照射30 min,避光放置15 min,再与THP-1细胞共同孵育,之后进行后续的与其它受试物相同的试验操作,并检测CD54和CD86的表达水平。确定以细胞表面标志物为评价指标的THP-1细胞光致敏体外评价方法的具体评价指标和阳性结果判定标准,并对建立的方法进行准确性、特异性、灵敏度和重复性的验证。2、以细胞因子为评价指标的光致敏体外评价方法的验证本部分方法中所用受试物与第一部分相同。将THP-1细胞与上述多种不同类型的受试物分别孵育24h,每种受试物3-4个孵育浓度(皮肤刺激剂和阴性化合物为一个浓度),之后进行UVA照射,照射强度为1.7 mw/cm2,照射或避光处理时间为50 min在照射结束后5 h用Luminex技术检测各个受试物照射组和非照射组THP-1细胞上清液和裂解液中IL-8和TNF-α的含量,并计算照射组/非照射组IL-8含量的比值和照射组/非照射组TNF-α含量的比值。对于具有光刺激性的4种受试物及部分光致敏剂额外增加预照射处理试验组,即先将受试物加入细胞培养基内(无细胞),UVA照射30 min,避光放置15 min,再与THP-1细胞共同孵育,之后进行后续的与其它受试物相同的试验操作,并检测IL-8和TNF-α的含量。确定以细胞因子为评价指标的THP-1细胞光致敏体外评价方法的具体评价指标和阳性结果判定标准,并对建立的方法进行准确性、特异性、灵敏度和重复性的验证。研究结果1、以细胞表面标志物为评价指标的光致敏体外评价方法的验证THP-1细胞分别与多种不同浓度的光致敏剂孵育并经UVA照射后,19种光致敏剂中有15种引起照射组THP-1细胞表达CD54的MFI较非照射组显著性增加,,且照射组CD54的RFI值均在1.5以上。4种光刺激剂与THP-1细胞孵育以及UVA照射后也可引起细胞表达CD54的MFI显著性增加,但经过预照射处理后,预照射组CD54的表达比直接照射组(未经预照射)显著下降,预照射处理可以对光刺激剂和光致敏剂进行鉴别。本研究中所有光致敏剂和光刺激剂均未引起THP-1细胞光照前后CD86表达的明显变化。皮肤致敏剂DNCB和CHD在未经UVA照射时即可引起THP-1细胞表达CD54的MFI显著性增加,在照射后CD54 MFI没有进一步增加,反而比照射前略有下降。非照射和照射条件下,皮肤致敏剂均可引起THP-1细胞表达CD86比细胞对照组显著性增加。皮肤致敏剂引起CD54和CD86表达变化的特点与光致敏剂明显不同。皮肤刺激剂和阴性受试物均未引起照射组THP-1细胞表达CD54和CD86的显著性变化,其照射组CD54的RFI值均小于1.5。基于以上结果,确定与受试物孵育并经紫外照射后THP-1细胞表达CD54的MFI和RFI为以细胞表面标志物为评价指标的光致敏体外评价方法的具体评价指标。初步确定了该方法中受试物光致敏阳性的判定标准:①紫外照射后THP-1细胞表达CD54的MFI 比照射前显著性增加;②紫外照射后THP-1细胞表达CD54的RFI≥1.5。③当上述两条均满足时,应对受试物进行预照射处理,预处理照射组CD54 RFI≥1.5并且与直接照射组(未经预照射)CD54的RFI相比无显著性差异。同时满足这三个条件则可判定受试物为光致敏阳性。对该方法进行方法学验证的结果显示其评价化合物光致敏性的准确度为85.2%,特异性为100%,灵敏度为78.9%,重复性较好。2、以细胞因子为评价指标的光致敏体外评价方法的验证THP-1细胞分别与多种不同浓度的光致敏剂孵育并经UVA照射后,19种光致敏剂中有13种引起照射组THP-1细胞分泌IL-8比非照射组显著性增加,且照射组/非照射组IL-8含量比值均在6.5以上。有8种光致敏剂引起照射组THP-1细胞分泌TNF-α显著性增加,但增加的幅度明显小于IL-8增加的幅度。光刺激剂与THP-1细胞孵育以及UVA照射后也可引起细胞分泌IL-8显著性增加,但经过预照射处理后,预照射组IL-8含量比直接照射组(未经预照射)显著下降,且预处理照射组/非照射组IL-8含量比值小于6.5。皮肤致敏剂在未经UVA照射时即可引起THP-1细胞分泌IL-8显著性增加,在照射后也会引起THP-1细胞表达IL-8比非照射组显著性增加,照射组/非照射组IL-8含量比值小于6.5。照射条件下,皮肤刺激剂SLS和阴性受试物乳酸也引起THP-1细胞分泌IL-8显著性增加,但照射组/非照射组IL-8含量比值均小于6.5。本研究中的光刺激剂、皮肤致敏剂、皮肤刺激剂、阴性受试物均未引起THP-1细胞光照后TNF-α含量的显著性变化。基于以上结果,确定与受试物孵育并经紫外照射后THP-1细胞中IL-8含量以及照射组/非照射组IL-8的含量比值作为以细胞因子为评价指标的光致敏体外评价方法的具体评价指标,并初步确定了该方法中受试物光致敏阳性的判定标准:①UVA照射后THP-1细胞中IL-8含量比非照射组显著性增加;②UVA照射组IL-8含量/非照射组IL-8含量比值多6.5;③当上述两条均满足时,对受试物进行UVA预照射处理,预处理照射组IL-8的含量与直接照射组(未经预照射)相比无显著性差异,且预处理照射组IL-8含量/预处理非照射组IL-8含量比值≥6.5。同时满足以上条件则可判定受试物为光致敏阳性。对该方法进行方法学验证的结果显示其评价化合物光致敏性的准确度为77.8%,特异性为100%,灵敏度为68.4%,重复性较好。研究结论本研究分别建立了以CD54和IL-8为评价指标的两种THP-1细胞光致敏体外评价方法,确定了受试物光致敏阳性的判定标准。经验证,两种光致敏体外评价方法具有较好的准确度、特异性、灵敏度和重复性。
【学位授予单位】：中国食品药品检定研究院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R96;TQ658
【图文】：

克洛,百分比,细胞,与非

中国食品药品检定研究院硕士毕业论文(5) 芬替克洛引起光照前后 THP-1 细胞 CD54、CD86 的表达如图 1-5、表 1-4 所示，当芬替克洛浓度分别为 5 μg/mL、7.5 μg/mL、10 μg/mL时，芬替克洛照射组与非照射组相比，表达 CD54 阳性细胞百分比未有显著性差异；平均荧光强度 MFI 显著性增加（P≤0.01），增加的百分比约为 9%-32%；受试物照射组与细胞对照照射组相比，表达 CD54 阳性细胞百分比和 CD54 的 MFI也显著性增加（P≤0.01）。受试物组与细胞对照组相比，THP-1 细胞表达 CD86无显著性变化；受试物照射组与非照射组相比，THP-1 细胞表达 CD86 也无显著性变化。

葵子麝香,与非,磺胺,细胞

图 1-6 不同浓度下葵子麝香引起细胞表达 CD54 和 CD86 的平均荧光强度UVA- ：非照射组；UVA+ ：照射组；照射组与非照射组相比，#P<0.05，##P<0.01;受试物组与细胞对照组相比，*P<0.05，**P<0.01(7) 磺胺引起光照前后 THP-1 细胞 CD54、CD86 的表达如图 1-7、表 1-4 所示，当磺胺浓度分别为 1500 μg/mL、2000 μg/mL、2500μg/mL 时，氯丙嗪照射组与非照射组相比，表达 CD54 阳性细胞百分比未有显著性差异；平均荧光强度 MFI 显著性增加（P≤0.01），增加的百分比约为 30%-47%；受试物照射组与细胞对照照射组相比，表达 CD54 阳性细胞百分比和 CD54 的MFI 显著性增加（P≤0.01）。受试物组与细胞对照组相比，THP-1 细胞表达 CD86无显著性变化；受试物照射组与非照射组相比，THP-1 细胞表达 CD86 也无显著性变化。

与非,细胞,百分比,对照组

图 1-7 不同浓度下磺胺引起细胞表达 CD54 和 CD86 的平均荧光强度UVA- ：非照射组；UVA+ ：照射组；照射组与非照射组相比，#P<0.05，##P<0.01;受试物组与细胞对照组相比，*P<0.05，**P<0.01(8) 硫氯酚引起光照前后 THP-1 细胞 CD54、CD86 的表达如图 1-8、表 1-4 所示，当硫氯酚浓度分别为 30 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL、60 μg/mL 时，硫氯酚照射组与非照射组相比，表达 CD54 阳性细胞百分比未有显著性差异；平均荧光强度 MFI 显著性增加（P≤0.01），增加的百分比约为25%-50%；受试物照射组与细胞对照照射组相比，表达 CD54 阳性细胞百分比未增加，CD54 的 MFI 显著性增加（P≤0.01）。受试物组与细胞对照组相比，THP-1细胞表达 CD86 无显著性变化；受试物照射组与非照射组相比，THP-1 细胞表达CD86 也无显著性变化。

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