P-糖蛋白抑制剂筛选模型的构建及其在化合物评价中的应用

发布时间：2017-03-29 20:19

  本文关键词：P-糖蛋白抑制剂筛选模型的构建及其在化合物评价中的应用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)是一种重要的外排转运体,在药物的吸收、分布、代谢和排泄的过程中起到重要的作用,也是肿瘤多药耐药产生的原因之一。P-gp抑制剂的筛选及其介导的药物转运研究在新药研发中受到越来越多的关注。本文中,我们首先构建了caco-2细胞单层转运模型,并从跨膜电阻的测定和显微结构的观察两个方面对细胞单层的完整性进行了验证。其次,我们构建了小鼠小肠3D类器官研究P-gp的模型,从mRNA水平和蛋白水平对3D类器官与小鼠小肠中P-gp的表达进行了比较。在此模型的基础上,我们创造性地使用超声波细胞破碎仪和多功能酶标仪分别对样品进行处理与检测,建立了一种更加快速、高效的P-gp抑制剂筛选的方法。再次,我们在体内实验中选择茚地那韦作为P-gp的底物,通过茚地那韦药代动力学行为的变化来评价化合物对P-gp的作用。基于上述P-gp抑制剂体外体内筛选模型,我们评价了一些中草药单体和小分子化合物对P-gp的抑制作用。研究结果发现,中药单体葫芦素E可以显著抑制地高辛(P-gp的底物)跨caco-2细胞单层的外排,并明显减少罗丹明123(P-gp的底物)在3D类器官中的累积。在大鼠体内单次给药实验中,葫芦素E显著增加茚地那韦的达峰浓度(Cmax)和药时曲线下面积(AUC0-t),降低表观分布容积(Vd)和血浆清除率(CL),增加了茚地那韦的吸收,减少了外排。因此,..葫芦素E在体外体内均抑制了P-gp的活性。此外,小分子化合物LN-505和WG-491抑制地高辛跨caco-2细胞单层的外排,但对茚地那韦的体内药动学参数没有显著的影响,表明这两种化合物对P-gp的抑制作用在体外体内存在差异。总之,本文所建立的P-gp抑制剂筛选模型可以对化合物进行体外和体内的综合评价,为P-gp介导的药物转运研究提供了强有力的工具。
【关键词】：Caco-2细胞 3D类器官 P-糖蛋白 茚地那韦 LC-MS/MS
【学位授予单位】：华东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R96
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-13
• 第一章 绪论13-32
• 1.1 药物转运体13-17
• 1.1.1 可溶性物质载体转运体13
• 1.1.2 ATP结合盒转运体13-17
• 1.2 P-糖蛋白17-24
• 1.2.1 P-糖蛋白概述17-18
• 1.2.2 P-糖蛋白的分布及生理作用18-21
• 1.2.3 P-糖蛋白的底物21-22
• 1.2.4 P-糖蛋白的抑制剂22-24
• 1.3 P-糖蛋白抑制剂在新药研发中的作用24-26
• 1.3.1 P-糖蛋白抑制剂与生物利用度24-25
• 1.3.2 P-糖蛋白抑制剂与肿瘤25-26
• 1.4 P-糖蛋白抑制剂的筛选模型26-30
• 1.4.1 以膜为基础的模型26-28
• 1.4.2 以细胞为基础的模型28-30
• 1.5 本课题的意义及创新之处30-32
• 第二章 Caco-2细胞单层模型的构建及验证32-48
• 2.1 前言32-33
• 2.2 实验材料33-35
• 2.2.1 细胞株33
• 2.2.2 主要实验试剂及耗材33-34
• 2.2.3 主要实验仪器34-35
• 2.2.4 主要试剂的配制35
• 2.3 实验方法35-42
• 2.3.1 细胞培养35-36
• 2.3.2 Caco-2细胞单层模型的建立及验证36-40
• 2.3.3 测定地高辛的LC-MS/MS分析方法的建立40-42
• 2.4 实验结果与分析42-48
• 2.4.1 跨膜电阻(TEER)的测定42-43
• 2.4.2 Caco-2细胞的显微结构43-44
• 2.4.3 地高辛的分析方法学确证44-48
• 第三章 小鼠小肠3D类器官模型的构建及验证48-61
• 3.1 前言48-49
• 3.2 实验材料49-52
• 3.2.1 实验动物49
• 3.2.2 主要实验试剂及耗材49-50
• 3.2.3 主要实验仪器50-51
• 3.2.4 主要试剂的配制51-52
• 3.3 实验方法52-58
• 3.3.1 隐窝的分选及3D类器官的培养52-53
• 3.3.2 3D类器官模型的验证53-57
• 3.3.3 3D类器官的处理及罗丹明123检测方法的建立57-58
• 3.4 实验结果与分析58-61
• 3.4.1 3D类器官模型的验证58-59
• 3.4.2 罗丹明123的标准曲线59-61
• 第四章 P-糖蛋白抑制剂筛选模型在化合物评价中的应用61-89
• 4.1 前言61-62
• 4.2 实验材料62-65
• 4.2.1 实验动物62
• 4.2.2 主要实验试剂及耗材62-63
• 4.2.3 主要实验仪器63-64
• 4.2.4 主要试剂的配制64-65
• 4.3 实验方法65-74
• 4.3.1 地高辛跨caco-2细胞单层的转运65-66
• 4.3.2 Caco-2细胞中P-糖蛋白表达的检测66-69
• 4.3.3 罗丹明123跨3D类器官的转运69-70
• 4.3.4 测定茚地那韦的LC-MS/MS分析方法的建立70-72
• 4.3.5 茚地那韦的药代动力学研究72-74
• 4.4 实验结果与分析74-89
• 4.4.1 不同化合物对地高辛转运的影响74-75
• 4.4.2 葫芦素E对地高辛转运的影响75-76
• 4.4.3 葫芦素E对P-gp表达的影响76-77
• 4.4.4 葫芦素E对罗丹明123转运的影响77-78
• 4.4.5 茚地那韦的分析方法学确证78-81
• 4.4.6 葫芦素E对茚地那韦药代动力学的影响81-85
• 4.4.7 化合物LN-505对茚地那韦药代动力学的影响85-87
• 4.4.8 化合物WG-491对茚地那韦药代动力学的影响87-89
• 第五章 讨论89-95
• 第六章 结论95-96
• 参考文献96-109
• 附录Ⅰ 缩略词及中英文对照表109-111
• 附录Ⅱ 硕士期间科研成果111-112
• 致谢112-113

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