恩再适的抗肿瘤效应研究

发布时间：2020-07-13 17:24

【摘要】：目的:肿瘤严重威胁人类生命健康,且发生率呈逐年上升趋势。目前,大多数化疗药物属于细胞毒类药物,毒副作用大。因此,寻找安全有效的抗肿瘤药物已成为科学家和临床医学工作者面临的重大挑战。恩再适(analgecine,AGC),系牛痘疫苗致炎兔的皮肤提取物,是在健康家兔皮肤内接种人用牛痘疫苗产生的小分子非蛋白活性物质。恩再适对神经损伤或由其他疾病引起的慢性疼痛、冷感、麻木等症状均有显著疗效,除此之外,恩再适还具有抑制或减轻炎症反应、双向调节机体免疫的作用,然而肿瘤的发展过程与炎症反应及免疫功能低下都息息相关。因此,探讨恩再适是否具有抗肿瘤作用,无疑具有重要的理论意义和潜在的应用价值。方法:(1)体外抑瘤活性检测:复苏培养Hep G2、LM3、He La、A549和H460五种人源肿瘤细胞,以不同浓度恩再适分别作用上述细胞24 h,使用CCK-8法检测细胞增殖活性。(2)淋巴细胞因子分泌刺激实验:无菌分离小鼠脾脏,制备并培养脾淋巴细胞,不同浓度恩再适作用于细胞24 h,收集上清,采用ELISA试剂盒检测恩再适对其分泌细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-12的影响。(3)淋巴细胞刺激上清对肿瘤细胞的影响:采用恩再适刺激脾淋巴细胞,将其上清液以不同体积比分别与Hep G2细胞共培养24 h,使用CCK-8法检测细胞增殖活性。(4)体内抑瘤活性:将皮下接种LM3成瘤的BALB/C裸鼠随机分成5组,分别是空白对照组,阳性对照组,恩再适低、中、高剂量组。空白对照组给予0.9%氯化钠注射液,0.2 ml/d;阳性对照组给予环磷酰胺,20 mg/kg,隔天给药一次;恩再适低、中、高剂量组,分别给予0.01 U/g/d、0.02 U/g/d和0.04 U/g/d。给药方式均为腹腔注射,连续给药15天,动态监测肿瘤体积及体重。结束实验时取出肿瘤组织和脾脏组织并进行称重和测量,计算抑瘤率和脾脏指数。(5)联合给药体内抑瘤实验:将皮下接种LM3成瘤的BALB/C裸鼠随机分成5组,分别是对照组,恩再适组,环磷酰胺低、高剂量组,恩再适与环磷酰胺联合给药组。对照组给予0.9%氯化钠注射液,0.2 ml/d;恩再适组,0.02 U/g/d;环磷酰胺低、高剂量组,分别给予10 mg/kg和20 mg/kg,隔两天给一次药;恩再适与环磷酰胺联合给药组,0.02 U/g+10 mg/kg,恩再适每天给一次药,环磷酰胺隔两天给一次药。给药方式均为腹腔注射,连续给药15天。结束实验时将肿瘤组织和脾脏组织取出并进行称重和测量,计算抑瘤率和脾脏指数。结果:(1)恩再适对培养的肿瘤细胞具有一定的增殖抑制活性:随恩再适浓度的增加,5种肿瘤细胞的抑制率逐渐增加,当恩再适浓度达到1.63 U/ml时,对Hep G2、LM3、H460、A549、He La细胞的抑制率分别为58.95%、55.08%、57.28%、45.80%、48.18%。(2)恩再适具有刺激淋巴细胞分泌细胞因子的作用:采用不同浓度恩再适作用脾淋巴细胞后,IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-12的分泌水平均有所提高。与对照组相比,恩再适0.163和0.815 U/ml组脾淋巴细胞IL-2、IFN-γ和IL-4的分泌水平显著提高(P0.01)。恩再适0.0815、0.163和0.815 U/ml组IL-12的分泌水平均显著提高(P0.01)。(3)恩再适刺激的脾淋巴细胞上清液使Hep G2细胞增殖受到抑制,当上清液体积达到100%,与相同浓度恩再适单独处理组相比,Hep G2细胞的增殖显著抑制(P0.01)。(4)恩再适体内抑瘤活性:恩再适低、中、高剂量组的裸鼠体重变化曲线与空白对照组基本一致,各组之间没有统计学差异(P0.05)。实验结束时,恩再适低、中、高剂量组的抑瘤率分别为25.24%、34.71%、49.86%,脾脏指数分别为1.15、1.23、1.17,与空白对照组相比,各处理组均存在统计学差异(P0.05或P0.01)。(5)恩再适联合给药抑瘤效应:环磷酰胺低、高剂量组降低裸鼠体重,而恩再适组、联合给药组的裸鼠体重变化曲线与对照组基本一致,没有统计学差异(P0.05)。实验结束时,恩再适组,环磷酰胺低、高剂量组,联合给药组的抑瘤率分别为22.25%,33.21%,62.67%,60.95%,与对照组相比,各处理组均存在统计学差异(P0.01);与恩再适组或环磷酰胺低剂量组相比,联合给药组存在显著性差异(P0.01);与环磷酰胺高剂量组相比,联合给药组的差异无统计学意义(P0.05)。与联合给药组的脾脏指数相比,恩再适组和环磷酰胺低、高剂量组均存在统计学差异(P0.05),与对照组没有统计学差异(P0.05)。结论:恩再适一方面对体外培养的肿瘤细胞具有增殖抑制的作用,另一方面,能够通过上调体外培养的小鼠脾淋巴细胞中IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-12的分泌水平,增强细胞免疫功能,进一步增强其抗肿瘤的作用。恩再适对机体无毒副作用,安全性高,能够提高机体免疫功能,抑制裸鼠LM3皮下移植瘤的生长。恩再适还可以作为抗癌辅助药与化疗药物环磷酰胺联合使用,不仅能够降低环磷酰胺用量以减轻其对机体的损害,还能够起到抗瘤增效作用,预示恩再适在癌症治疗方面的应用前景十分广阔。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R96
【图文】：

上清液,淋巴细胞,活性因子,脾淋巴细胞

图 1 恩再适对小鼠脾淋巴细胞上清中 IL-2（A）、IFN-γ （B）、IL-4（C）和 IL-12（D）的影响注：*P＜0.05，**P＜0.01，与阴性对照组比较； x±s，n=3Fig.1 The effect of analgecine on the IL- 2（A），IFN- γ （B），IL- 4（C） and IL-12（D） produced by the cultured mice splenic lymphocytes.*P＜0.05，**P＜0.01，compared with control group； x±s，n=33.3 恩再适刺激淋巴细胞上清液对 HepG2 细胞增殖的影响淋巴细胞上清液中含有多种免疫活性因子，综合上述 ELISA 检测结果，采用恩再适 0.163 U/ml 刺激脾淋巴细胞上清液作用于 HepG2 细胞。结果如图 2 所示，

曲线,移植瘤,裸鼠,体重

图 3 恩再适对 LM3 移植瘤裸鼠体重的影响（ x±s，n=6）Fig.3 Effect of analgecine on body weight of LM3 nude mice（ x±s，n=6）2 恩再适对人肝癌裸鼠皮下移植瘤的抑制作用将人肝癌细胞 LM3 接种于 BALB/C 裸鼠皮下，接种后当肿瘤体积长至 100-30时，按照肿瘤体积随机分组给药，分为空白对照组，阳性对照组，恩再适低高剂量组共五组。使用游标卡尺测量肿瘤长径（a）、短径（b），计算肿瘤体，绘制肿瘤生长曲线。从各组的肿瘤体积增长情况来看，阳性对照组和恩再适中高剂量组在给药第六天，与空白对照组相比较，已存在统计学差异（P＜0.05图 4），且抑瘤作用与计量有一定相关性。第十六天结束实验时，空白对照组鼠的肿瘤重量为 1.01±0.24 g，阳性对照组的瘤重为 0.21±0.10 g，恩再适剂量组（0.01 U/g）、中剂量组（0.02 U/g）、高剂量组（0.04 U/g）的瘤重

裸鼠,块结,肿瘤组织,移植瘤

图 4 恩再适对 LM3 移植瘤裸鼠瘤体积的影响（ x±s，n=6）4 Effect of analgecine on tumor volume in LM3 transplanted nude mice（ x±

【参考文献】