组蛋白去乙酰化酶抑制剂毛细管电泳在线活性筛选方法的研究

发布时间：2020-07-13 22:22

【摘要】：组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylase,HDACs)可催化水解底物ε-N-乙酰化赖氨酸残基脱除乙酰基,其底物包括组蛋白或非组蛋白的底物。该酶在表观遗传调控和多种细胞的调节过程中起关键作用,特别是该酶在许多肿瘤组织中高表达,HDACs成为癌症治疗领域的热门靶标。组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitors,HDACi)可引起肿瘤细胞凋亡、细胞周期阻滞和DNA损伤等作用,目前已有多个药物上市。当前在HDAC抑制剂的研发中,急需发展新型的高通量HDACs抑制剂筛选方法,以加快药物发现的速度。随着近十几年的发展,毛细管电泳(capillary electrophoresis,CE)已成功应用于多种药物靶标的活性筛选。该方法的主要优点包括测试模式多且效率高、分析时间短、酶和底物消耗量低以及能够实现自动化运行。除了传统的离线分析手段,该领域还发展了毛细管在线分析技术,包括电泳调控微分析法和固定化酶微反应器法。这两种常见的毛细管在线分析手段已被广泛应用于酶学研究。电泳调控微分析法(Electrophoretical mediated microanalysis,EMMA)是在毛细管内,同时进行酶促反应以及其底物和产物分离测试的在线分析方法。该方法将酶和底物依次进样至毛细管前端,并以此作为酶促反应发生场所。通过施加电压,促使酶和底物在管内充分混合反应;反应结束后,施加分离电压使产物和未反应底物在毛细管内分离并进行测定。毛细管电泳固定化酶微反应器(Capillary electrophoresis immobilized enzyme microreactor,CE-IMERs)是将毛细管电泳与固定化酶技术相结合的新型在线酶学测定方法。该方法通过一定的固定化方式将靶酶固定在毛细管的进样端,于是制备得到CE-IMERs,用于酶促反应动力学和酶抑制剂动力学在线研究。该法的优点在于试剂消耗量小、操作简便、可实现靶酶的重复使用,是新型的酶抑制剂高通量筛选方法。我们应用电泳调控微分析法,实现了 HDACs抑制剂的毛细管电泳在线筛选,为该类抗肿瘤药物的研发提供了新的筛选模型。本文对分离条件、混合条件等方面进行了优化,并对初步建立的方法进行了方法学验证,证明该方法稳定、高效、可重复。我们应用所建方法测定了 HDACs的动力学参数和3种经典HDACs抑制剂的表观抑制常数。本文建立的EMMA方法测定结果与经典荧光法及文献报道结果基本一致,说明该法结果准确、可靠。本文使用海藻酸钙包埋法制作了 HDACs毛细管电泳固定化酶微反应器,通过将含有HDACs的海藻酸钠溶胶灌注于毛细管一端,施加电压驱动缓冲液中钙离子通过溶胶区域与钠离子置换,在毛细管端口形成海藻酸钙凝胶,从而将HDACs包埋并固定在毛细管端口。经条件优化,初步建立的毛细管电泳固定化酶微反应器稳定性和批间重复性良好,所测定的HDACs酶促反应动力学结果和HDACs抑制剂动力学结果与文献报道基本一致。以上结果说明,本法制得的CE-IMERs具有测试简单高效、节约反应物料以及自动化程度高等优点,未来可能成为组蛋白去乙酰化酶抑制剂研发的有力武器。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R91
【图文】：

山东大学硕士学位论文逡逑目前肿瘤药物研究的热点话题之一，目前经典的ＨＤＡＣｓ抑制剂的结构分为逡逑部分：表面识别区、铰链区和锌离子螯合基团（见图Ｍ）邋＾抑制剂的类型逡逑锌离子螯合基团的不同分为可以为异羟肟酸类（如Ｍｅｒｃｋ公司研制的逡逑ｏｓｔａｔ和Ｔｓｕｊｉ发现的天然产物ＴｒｉｃｈｏｓｔａｔｉｎＡ）、邻苯二胺类（如Ｍｉｔｓｕｉ逡逑ｉｃａｌｓ公司开发的Ｅｎｔｉｎｏｓｔａｔ和国产原研抗癌药物西达本胺）和环肽类（如逡逑ｃｅｓｔｅｒ邋研发的邋Ｒｏｍｉｄｅｐｓｉｎ）。［２４，２５］逡逑

Ｆｉｇｕｒｅ邋１－２邋ＨＤ邋ＡＣ邋ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｍａｒｋｅｔ逡逑１．２．２组蛋白去乙酰化酶抑制剂的作用机制逡逑现阶段研宄表明，组蛋白去乙酰化酶主要作用于癌异常乙酰化的组蛋白上其去乙酰化，从而影响下游众多信号通路，实现其抗肿瘤活性。其具体作用主要为以下几个方面：逡逑表１－３组蛋白去乙酰化酶的作用机制逡逑Ｔａｂｌｅ邋１－３邋Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ邋ｏｆ邋ＨＤＡＣｉ逡逑功能表现逦作用机制逡逑阻滞肿瘤细胞的逦抑制细胞周期蛋ｄ和周期蛋ａ依赖性激酶的细胞周期逦肿瘤细胞停滞在Ｇ１或Ｇ２／Ｍ期逡逑诱导肿瘤细胞凋亡逦胞外细胞凋亡通路：上调死亡受体及于其相关蛋

者的相互作用使含有放射性的乙酰基与闪烁剂靠近，激发ＳＰＡ珠闪烁，从而被逡逑闪烁计数器检测。而经ＨＤＡＣｓ催化的脱乙酰化的底物中［３Ｈ］脱落，从而使ＳＰＡ逡逑信号减少。通过测定ＳＰＡ信号的多少来反应ＨＤＡＣｓ的活性。方法原理如图１－３逡逑所示。此方法可在微孔板中直接测定ＳＰＡ的强度，无需提取分离步骤。逡逑１０逡逑

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本文编号：2754060