呕吐毒素对IPEC-J2细胞凋亡和功能的影响研究

发布时间：2020-07-14 15:16

【摘要】：呕吐毒素,又名DON(deoxynivalenol,脱氧雪腐镰刀菌烯醇),属于单端孢霉烯族类化合物,是一类强有力的免疫抑制剂。DON易感染谷物、玉米、红薯等常用农作物,除此之外,还会污染动物的次生代谢产物,如猪肉、牛奶、羊血等。因此,对人类及动物的健康构成了威胁,特别是对免疫功能具有明显的影响。猪是对其最敏感的家畜之一,而肠道作为营养物质吸收的主要场所,也是DON攻击的第一靶标。DON有很高的免疫抑制和细胞毒素作用,根据DON的剂量和作用时间不同可引起免疫刺激或免疫抑制。当人食用了被DON污染的食物后,会导致厌食、呕吐、发烧、腹泻、站立不稳、反应迟钝等急性中毒症状,严重时影响造血系统甚至死亡。中国传统饮食习惯中粮谷比例远远高于西方,使得呕吐毒素的危害更为突出。目的:通过空肠上皮细胞系IPEC-J2为模型,筛选合适的DON作用浓度和时间。从CCK-8实验检测细胞增殖率;细胞周期和凋亡检测;Werstem-Blot检验Caspase3(17)和Caspase3(32)的表达;实时荧光定量分别检测相对定量中细胞因子、线粒体氧化应激、游离氨基酸转运载体的相关目的基因表达量。通过这些指标来观测DON对IPEC-J2凋亡和功能的影响。方法:1)不同浓度DON作用不同时间对IPEC-J2细胞CCK-8增殖实验:用96孔板培养细胞,进行24小时、48小时、72小时培养,设置低浓度200ng/mlDON,高浓度2000ng/mlDON,通过测量培养基OD值计算细胞相对生存率。2)不同DON浓度处理后IPCE-J2细胞周期检测:用培养皿培养细胞,用高浓度2000ng/mlDON、低浓度200ng/m1DON处理细胞6小时、12小时、24小时,按照试剂盒进行实验操作,分析PI荧光直方图上细胞各周期的百分率。3)不同DON浓度处理后IPCE-J2细胞凋亡检测:细胞培养同上,按照试剂盒操作,在流式细胞仪观察检测,收集闪点图,进行凋亡率统计。4)DON处理后IPEC-J2细胞在Caspase3基因上的蛋白表达实验:细胞培养同上,加入50ulRIPA裂解液,裂解。检测蛋白浓度、电泳、转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育、显色曝光、灰度分析、数据处理。5)DON处理后IPEC-J2细胞在(细胞因子、线粒体氧化应激、氨基酸转运载体)基因上的qRTPCR实验:细胞培养和DON处理,提取RNA、RNA浓度测定、DNA去除反应、反转录、实时荧光定量、数据处理。结果:1)DON对IPEC-J2细胞生长有显著影响,抑制细胞增殖。选取24小时为终止时间段,分别进行6、12、24小时的研究。2)200ng/mlDON组细胞有丝分裂更多停留在S期,2000ng/mlDON更多停留在G2/M期。3)DON作用短时间6小时,细胞早期凋亡率和总凋亡率随着DON浓度上升而增高。4)DON激活细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶Caspase3(17)片段,作用时间在6小时效果显著。5)细胞因子相关基因表达:高浓度2000ng/mlDON两个基因表达上均显著升高,显著激活IL-8、IL-1β炎症基因的表达。线粒体氧化应激相关基因表达:DON作用12小时后高浓度2000ng/ml使TFAM、mtSSB、ND4、CCOXIV表达量显著上升,Cytc在24小时表达量增高。游离氨基酸转运载体基因表达:DON在作用12小时会抑制营养物质游离氨基酸转运载体Bo+AT的表达,24小时后抑制SGLT1、ASCT2、GIUT2表达。结论:DON对IPEC-J2细胞生长具有显著影响,通过抑制其增殖,诱导凋亡和刺激炎症反应等来实现。其中低浓度200ng/mlDON使细胞有丝分裂停留在S期;高浓度DON使细胞周期停留在有丝分裂后期G2/M期。在细胞凋亡上DON主要作用在6小时或之前时间段,此结果与在6小时左右启动了 Caspase3基因有关。高浓度 2000ng/mlDON 作用 12 小时 TFAM、mt SSB、ND4、CCOXV、CCOXIV表达量上升。mtSSB表达失调,mtDNA发生基因突变,如高氧化应激、水解脱氨基反应、烷基化作用,DNA损伤将大量积累,最终导致多种相关疾病的发生。ND4基因促使遗传性视神经病,线粒体肌病,张力障碍等相关疾病发生。CCOXIV基因促使细胞色素加深,细胞膜趋向老化。氨基酸转运载体的表达中DON处理低浓度和高浓度作用12小时在Bo+AT、SGLT1表达上均有下降,说明此浓度DON抑制糖类被动吸收,阻碍果糖和半乳糖转运,小肠转运葡萄糖的效率降低,从而引起代谢障碍,其中低浓度200ng/ml作用更明显。
【学位授予单位】：湖南中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R99
【图文】：

１．５实验结果逡逑１．５．１数据分析逡逑结果图１，使用ＳＰＳＳ邋Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ邋２２—般线性模型，单变量，因变量为生存率，固定逡逑因子为浓度和时间，黏贴制定程序如下：逦逡逑ＤＡＴＡＳＥＴ邋ＡＣＴＩＶＡＴＥ邋数据集邋０．逡逑ＵＮＩＡＮＯＶＡ生存率ＢＹ时间浓度逡逑／ＭＥｍ0Ｄ＝ＳＳＴＹＰＥ（３）逡逑／ＩＮＴＥＲＣＥＰＴ－ＩＮＣＬＵＤＥ逡逑／ＰＯＳＴＨＯＣ＝时间浓度（ＳＮＫ）逡逑／ＣＲＩＴＥＲＩＡ＝ＡＬＰＨＡ（０．０５）逡逑／ｅ＿ｅａｎｓ＝ＴＡＢＬＥＳ（时间邋＊浓度）ＣＯＭＰＡＲＥ（浓度）ＡＤＪ（ＬＳＤ）逡逑／ｅ＿ｅａｎｓ＝ＴＡＢＬＥＳ（浓度＊时间）ＣＯＭＰＡＲＥ邋（时间）ＡＤＪ（ＬＳＤ）逡逑／ＤＥＳＩＧＮ＝时间浓度时间＊浓度．逦逡逑进行组内组间比较。在同一时间段与对照组相比

图２不同ＤＯＮ浓度处理不同时间的细胞周期荧光直方图逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２邋Ｔｈｅ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ邋ａｎｄ邋ｅｘｐｏｓｕｒｅ邋ｔｉｍｅ邋ｆｏｒ邋ｄｅｏｘｙｎｉｖａｌｅｎｏｌ（ＤＯＮ）逡逑ｏｎ邋ｃｅｌｌ邋ｃｙｃｌｅ邋ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ邋ｈｉｓｔｏｇｒａｍｓ逡逑２．３．２数据统计分析逡逑结果图３，使用ＳＰＳＳ＿Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ＿２２比较均值，单因素ＡＮＯＶＡ检验。低浓度逡逑２００ｎｇ／ｍｌＤＯＮ在ＩＰＥＣ－Ｊ２细胞有丝分裂早期（Ｇ０／Ｇ１）有促进作用（ｐ＜０．０５）；邋Ｓ期细胞增多逡逑0？＜０．０５）；Ｇ２／Ｍ期无差异0？＞０．０５）。氋浓度２０００ｎｇ／ｍｌＤＯＮ在Ｇ０／Ｇ１和Ｓ期无显著差异逡逑（ｐ＞０．０５）；邋Ｇ２／Ｍ邋期细胞显著增多（ｐ＜０．０５）。逡逑８逡逑

【参考文献】

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本文编号：2755133