诱导胃癌细胞衰老含氮杂环化合物的筛选及其作用机制的研究

发布时间：2020-07-15 00:30

【摘要】：背景:近年来,作为一种针对癌细胞无限增殖特性的治疗肿瘤的新途径,化疗药物诱导的癌细胞衰老逐渐成为研究人员关注的焦点。虽然已有大量的报道显示传统抗肿瘤药物能够通过诱导细胞衰老来抑制多肿瘤细胞的增殖,但是诱导胃癌细胞衰老的抗肿瘤药物的研究仍然比较少。随着对肿瘤分子生物学研究的不断深入,鉴于传统药物运用的局限性,通过化学合成新型小分子化合物已经成为全球生物医药领域研究的重点之一。因此,本论文主要通过筛选和鉴定诱导细胞衰老的新型小分子化合物,达到治疗胃癌的效果,并为抗肿瘤药物研发与合成提供理论依据。方法:通过MTT实验筛选出能够明显抑制胃癌细胞增殖的化合物,并验证抑制胃癌细胞增殖的效果。随后,我们使用流式细胞术研究化合物对胃癌细胞周期和凋亡的影响。首先,我们通过X-β-Gal染色实验检测胞内β-半乳糖苷酶活性,BrdU掺入实验检测DNA合成情况以及DAPI染色和免疫荧光实验检测核内异染色质结构的改变,研究了化合物诱导的细胞衰老特征。随后,通过Western blot实验检测了相关信号通路上蛋白的水平的变化,解析了化合物的作用机制。最后,我们通过皮下成瘤小鼠验证筛选出来的化合物在体内的抗肿瘤活性,苏木素-伊红染色和免疫组织化学检测肿瘤组织病理学特征以及相关蛋白水平的表达情况。结果:在本课题中,我们首先从48种化合物中筛选出的一种能明显抑制胃癌细胞增殖的化合物,4,5-二苯基-2-吡啶甲酸甲酯(4,5-diphenyl-2-methyl picolinate,DMP)。实验结果显示,DMP以剂量依赖的方式对MKN-28和MKN-45细胞表现出显著的细胞毒性作用。DMP化合物处理后的细胞阻滞在G2/M期,与对照组比较差异显著(P0.05或P0.01)。进一步的实验显示,DMP能够引起胃癌细胞产生细胞衰老的特征。DMP处理的大多数的胃癌细胞的衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)的活性显著提高,BrdU掺入明显减少以及SAHF的形成。通过对DMP诱导细胞衰老机制的研究发现,DMP可以在胃癌细胞中引发明显的DNA损伤(P0.05或P0.01),并且上调了衰老相关的信号蛋白p38、p-p38、p-p53、p21和p16的水平。另外,DMP化合物在高剂量的情况下能够明显抑制成瘤小鼠肿瘤的生长速度,并且上调了肿瘤组织衰老相关蛋白p53和p21的水平。结论:4,5-二苯基-2-吡啶甲酸甲酯能够抑制体外培养的MKN-28和MKN-45胃癌细胞的增殖,主要通过激活p53/p21信号通路诱导了胃癌细胞的衰老,并且在体内表现出良好的抑制肿瘤生长的效果,同时对小鼠的生长与器官并没有明显的毒性作用。
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R914
【图文】：

抗肿瘤药物,诱导细胞,自噬

江苏大学硕士学位论文解决耐药性的问题，恢复其对抗肿瘤的敏感性。1.3.6 m-TOR 抑制剂m-TOR 主要通过形成 m-TORC1 和 m-TORC2 复合物调节细胞代谢、细胞运动、细胞生存、蛋白合成、细胞自噬和转录[77]。过度激活 m-TOR 信号通路能够显著促进肿瘤的发生的发展。已有相关研究证实了通过抑制 m-TOR 可以显著增加肿瘤细胞对电子辐射的敏感性，m-TOR 抑制剂 Rapamycin 及其类似物可以诱导肿瘤细胞发生自噬，而细胞自噬目前被认为决定细胞从细胞凋亡向细胞衰老转换的开关[78]。

胃癌细胞株,化合物,人成纤维细胞

图 2.1 不同化合物对各种胃癌细胞株增殖的影响。 (A-D) 不同化合物在 300 μM 的浓度下处理 48 h 后，MTT 实验检测不同化合物对胃癌细胞 AGS、BGC823、MKN-28 和 MKN-45细胞增殖影响的结果 (n≥3)。Figure 2.1 Effects of different compounds on the proliferation of various cell lines. (A-D)Effects of different compounds on the proliferation of gastric cancer cells AGS, BGC823,MKN-28, and MKN-45 cells treated at a concentration of 300 μM for 48 h was examined by MTTassay (n≥3).2.3.2 筛选出 5 种没有明显抑制人成纤维细胞 IMR90 的增殖的化合物为了进一步研究第一轮筛选出来的化合物是否会对正常细胞产生细胞毒性作用，我们将筛选出来的 10 种化合物作用于人成纤维细胞 IMR90，在同样作用浓度和作用时间下，MTT实验检测10种化合物对人正常成纤维细胞增殖的影响。实验结果如图 2.2 所示，10 种化合物对 IMR90 的增殖影响效果不同，其中 5 种

生长曲线,化合物,成纤维细胞,胃癌细胞

江苏大学硕士学位论文的毒性作用。其他 5 种化合物 A-6，A-7，A-14，B-4 和 C-15 对人正胞 IMR90 的增殖没有明显的抑制作用。因此，我们挑选抑制效果不A-7，A-14，B-4 和 C-15 作为第二轮筛选的候选化合物。为了进一种化合物在四种胃癌细胞中的抑制增殖的效果，我们将进一步检测这在胃癌细胞中的浓度生长曲线。

【参考文献】