二甲双胍抑制肺泡上皮细胞间质转分化调控博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化

发布时间：2020-07-15 00:42

【摘要】：目的:探讨二甲双胍是否通过影响转化生长因子β1(Transforming Growth Factorβ1,TGF-β1)相关信号通路抑制肺泡上皮细胞间质转分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT),进而减轻肺纤维化的发生与发展,从而为其临床用药提供实验依据。方法:1.动物实验取8周龄雄性Sprague Dawley(SD)大鼠48只,体重(200±20 g),适应性喂养1周后,随机分为正常对照组、博莱霉素(Bleomycin,BLM)组、二甲双胍(100 mg·kg-1)剂量组及二甲双胍(300 mg·kg-1)剂量组。每组n=12。采用BLM(5 mg·kg-1)气管滴注诱导肺纤维化大鼠模型。造模后每天灌胃给药1次,对照组和BLM组给予等体积(1m L·100g-1)生理盐水,连续给药28天。HE染色和Masson染色观察肺组织病理学及胶原沉积的变化;免疫组化检测肺组织I型胶原(collagen I)、III型胶原(collagen III)和TGF-β1的表达;Western Blot法检测肺组织TGF-β1、collagen I、collagen III、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、波形蛋白(Vimentin)、E钙粘蛋白(E-Cadherin)、紧密连接蛋白-1(ZO-1)及p-ERK1/2和p-Smad2/3的表达;real time-PCR检测TGF-β1、collagen I、collagen III、α-SMA、Vimentin、E-Cadherin、ZO-1 m RNA的表达。2.细胞实验将大鼠Ⅱ型肺泡上皮(RLE-6TN)细胞随机分为6组:Control组、TGF-β1(5ng·ml-1)组、TGF-β1+二甲双胍(1、10、100μmol·L-1)组和二甲双胍100μmol·L-1单独组。细胞先用TGF-β1预处理1h,再加入不同剂量二甲双胍共处理48h。CCK8法检测细胞增殖。Western blot法检测collagen I、collagen III、α-SMA、Vimentin、E-Cadherin、ZO-1及p-ERK1/2和p-Smad2/3的蛋白表达水平;real time-PCR检测collagen I、collagen III、α-SMA、Vimentin、E-Cadherin及ZO-1 m RNA的表达。结果:1.动物实验(1)HE和Masson染色结果显示BLM组肺组织结构破坏严重,肺泡壁厚度明显增加,纤维化明显,肺泡间隔内成纤维细胞显著增多,且局部实变,肺组织胶原沉积明显增多。而不同剂量二甲双胍连续给药4周后能明显改善肺组织损伤,显著降低肺组织胶原的沉积。(2)免疫组化结果显示BLM组大鼠肺组织collagen I、collagen III以及TGF-β1的阳性表达明显升高,而不同剂量二甲双胍给药4周后能明显降低BLM诱导的肺纤维化大鼠肺组织collagen I、collagen III以及TGF-β1的表达。(3)real time-PCR结果显示,与正常组比较,BLM组肺组织TGF-β1、collagen I、collagen III、α-SMA、Vimentin m RNA表达水平均不同程度升高而E-Cadherin及ZO-1 m RNA表达水平均不同程度降低(P0.01);与BLM组相比,不同剂量二甲双胍给药4周后肺组织TGF-β1、collagen I、collagen III、α-SMA、Vimentin m RNA表达水平均不同程度降低而E-Cadherin及ZO-1m RNA表达水平均不同程度升高(P0.01或P0.05)。(4)Western Blot结果显示,与正常组比较,BLM组肺组织TGF-β1、collagen I、collagen III、α-SMA、Vimentin蛋白表达水平均不同程度升高而E-Cadherin及ZO-1蛋白表达水平均不同程度降低(P0.01);与BLM组相比,给予不同剂量二甲双胍4周后肺组织TGF-β1、collagen I、collagen III、α-SMA、Vimentin蛋白表达水平均不同程度降低而E-Cadherin及ZO-1蛋白表达水平均不同程度升高(P0.01或P0.05)。(5)与正常组比较,BLM组大鼠肺组织p-ERK1/2、p-Smad2/3蛋白表达水平均明显升高(P0.01);与BLM组相比,不同剂量二甲双胍给药4周后肺组织ERK1/2和Smad2/3磷酸化水平均不同程度下降(P0.01或P0.05)。2.细胞实验(1)不同剂量二甲双胍对TGF-β1诱导的细胞增殖具有不同程度的抑制作用(P0.01或P0.05)。(2)与Control组相比,TGF-β1组collagen I、collagen III、α-SMA、Vimentin m RNA和蛋白表达水平均不同程度升高而E-Cadherin及ZO-1 m RNA和蛋白表达水平均不同程度降低(P0.01);与TGF-β1组相比,不同剂量二甲双胍组collagen I、collagen III、α-SMA、Vimentin m RNA和蛋白表达水平均不同程度降低而E-Cadherin及ZO-1 m RNA和蛋白表达水平均不同程度升高(P0.01或P0.05)。(3)与Control组相比,TGF-β1组ERK1/2及Smad2/3蛋白磷酸化水平明显升高(P0.01);与TGF-β1组相比,不同剂量二甲双胍组ERK1/2及Smad2/3蛋白磷酸化水平明显降低(P0.01或P0.05)。结论:二甲双胍对博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化具有一定的缓解作用,其机制可能与其降低肺组织Smad2/3或ERK1/2磷酸化水平、进而抑制TGF-β1诱导的肺泡EMT有关。
【学位授予单位】：皖南医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R965
【图文】：

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图 1 二甲双胍对博莱霉素诱导的肺纤维化大鼠肺组织形态学的影响（HE 染色，×200）1.2 二甲双胍对博莱霉素诱导的肺纤维化大鼠肺组织胶原沉积影响Masson 染色结果显示对照组大鼠肺组织可见少量蓝色胶原纤维染色，博莱霉素组大鼠肺组织可见大量胶原纤维沉积。而经二甲双胍（100、300 mg·kg-1）

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图 2 二甲双胍对博莱霉素诱导的肺纤维化大鼠肺组织胶原的表达（Masson 染色，×200）1.4 二甲双胍对博莱霉素诱导的肺纤维化大鼠肺组织 collagenⅠmRNA 表达的影响Real time PCR 检测发现，与 Control 组相比，BLM 组大鼠肺组织 collagenⅠ

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图 3 二甲双胍对博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化肺组织 collagenⅠmRNA 的表达A：collagenⅠmRNA 表达水平；B：肺组织 collagenⅠ熔解曲线；C：肺组织 GAPDH 熔解曲线。数据表示为 x ± s，n = 8 ~12。**P<0.01 vs. Control；#P < 0.05,##P < 0.01 vs. Bleomycin。1.5 二甲双胍对博莱霉素诱导的肺纤维化大鼠肺组织 collagenⅠ蛋白

【参考文献】