GST同工酶在肿瘤细胞顺铂耐药及迁移过程中作用比较

发布时间：2020-07-15 01:56

【摘要】：在癌症病人中,肿瘤耐药和转移是导致治疗失败的重要原因。GST同工酶的异常表达与细胞耐药密切相关。双依他尼酸乙二胺(EDEA)为自主合成的芳香酰胺类GST抑制剂,其同工酶选择性为GSTMGSTAGSTP。前期研究发现其对耐顺铂卵巢肿瘤细胞株SKOV3/DDP及其荷瘤鼠有增敏作用,对肺癌耐药细胞株A549/DDP有增敏但对应荷瘤鼠无显著作用,而对胃癌耐药细胞株SGC7901/DPP无明显增敏效果。提示不同耐顺铂肿瘤细胞株可能存在不同耐药相关GST同工酶;对不同肿瘤设计相应GST同工酶选择性抑制剂必将面临技术和成本挑战,而识别与多种肿瘤细胞株耐药及迁移相关的GST同工酶为靶设计其抑制剂更具有现实意义。选择耐顺铂实体瘤细胞株肺癌A549/DDP、卵巢癌SKOV3/DDP、胃癌SGC7901/DPP。用western-blot检测上述几种耐药与非耐药肿瘤细胞裂解液GST同工酶蛋白表达,并通过EDEA作用检测裂解液中对抑制剂敏感的GST同工酶。再通过si RNA选择性沉默GST同工酶,CCK8检测耐药肿瘤细胞株DDP IC50比较增敏作用,同时通过流式细胞计数及Hoechst33343检测细胞凋亡情况。CCK8检测GST同工酶基因沉默及EDEA抑制作用下4HNE毒性作用,以探索可能作用机理。通过划痕实验及Transwell检测si RNA选择性沉默GST同工酶后对细胞迁移的影响,Western-blot检测EDEA对迁移相关信号通路蛋白表达影响。与非耐药细胞相比,上述耐顺铂肿瘤细胞株GST总活增加。Western-blot显示,A549/DDP中GSTP1、GSTA1蛋白表达降低,GSTM2表达增加;SGC7901/DDP中GSTP1、GSTM2及GSTA1蛋白表达降低;SKOV3/DDP中GSTP1、GSTM2及GSTA1蛋白表达增加。对EDEA作用最敏感的GSTM活性在SKOV3/DDP中显著增加,在SGC7901/DDP中有一定增加;对EDEA作用较敏感的GSTA在A549/DDP中显著增加。在不同细胞株,沉默GST同工酶显示不同的增敏作用。在A549/DDP中,沉默GSTM2、GSTA1分别增敏2倍、5倍,沉默GSTP1无显著影响;在SKOV3/DDP中,沉默GSTM2、GSTA均增敏2倍,沉默GSTP1无显著影响;在SGC7901/DDP中,沉默GSTP1、GSTM2、GSTA1分别增敏4倍、1.3倍、6倍。可见在三种细胞中,与GSTP1、GSTM2相比,GSTA1对耐药的作用最显著。流式细胞计数及Hoechst33343检测细胞凋亡发现相似结果。在A549/DDP中,沉默GST同工酶或EDEA抑制,4HNE IC_(50)显著降低。由于GSTM选择性抑制剂EDEA作用至使A549/DDP迁移增加,进一步考察沉默GST同工酶对A549/DDP迁移的影响。划痕实验及Transwell实验均显示,沉默GSTM2后A549/DDP细胞迁移能力与对照组比较显著增加,而GSTP1沉默及GSTA1沉默对其迁移能力无明显影响。Western blot实验显示EDEA增加细胞迁移的机制可能与激活EGFR进而激活AKT/PI3K通路有关。综上所述,GST表达及酶活增加与细胞耐药相关。通过EDEA抑制及GST同工酶基因沉默初步证明不同细胞株与耐药相关的GST同工酶不同;相对于GSTM2、GSTP1,沉默GSTA1对A549/DDP、SKOV3/DDP、SGC7901/DDP均有最显著的增敏作用,其增敏可能与4HNE有关,提示GSTA1可能是多种肿瘤耐药细胞逆转耐药的靶点;抑制或沉默GSTM2后,A549/DDP细胞迁移能力增加,机制可能与激活AKT/PI3K通路有关。提示GSTM不宜作为研究增敏的靶点。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R96
【图文】：

响应曲线,细胞株,裂解液,蛋白表达

图 1 不同细胞株裂解液 GST 对 EDEA 抑制响应曲线Fig1 Inhibition response of GST in different tumor cell lines against EDEA2.3 各细胞株中 GSTP1、GSTM2、GSTA1 蛋白表达Western blot 检测了 A549 与 A549/DDP、SGC7901 与/DDP、SKOV3 与SKOV3/DDP 细胞内 GSTP1、GSTM2、GSTA1 蛋白表达情况(图 2)，发现与敏感细胞株相比，耐顺铂细胞株 A549/DDP 中 GSTP1 及 GSTA1 蛋白表达增加，GSTM2蛋白表达降低；耐顺铂细胞株 SGC7901/DDP 中 GSTP1、GSTM2 及 GSTA1 蛋白表达降低；耐顺铂细胞株 SKOV3/DDP 中 GSTP1、GSTM2 及 GSTA1 蛋白表达增加。*p<0.05。bca

响应曲线,蛋白表达,细胞株,顺铂

细胞株,蛋白表达,细胞转染,调零

OD 值))/(对照孔 OD 值-调零孔 OD 值)。使用 SPSS 19.0 计算细胞 IC50。2 实验结果2.1 siRNA 沉默 GST 同工酶的有效序列筛选Western blot 结果检测了 A549/DDP，SKOV3/DDP，SGC7901/DDP 细胞转染不同 siRNA 后，GST 表达情况。选取相应的 GST siRNA 进行下一步实验。在A549/DDP，si-GSTP1 选择 siRNA1，si-GSTM2 选择 siRNA2，si-GSTA1 选择 siRNA1；在 SKOV3/DDP，si-GSTP1 选择 siRNA3，si-GSTM2 选择 siRNA2，si-GSTA1 选择siRNA2；在 SGC7901/DDP，si-GSTP1 选择 siRNA3，si-GSTM2 选择 siRNA1，si-GSTA1 选择 siRNA2(图 3)。

【参考文献】