K4多糖及其硫酸化衍生物结构和生物活性研究

发布时间：2020-07-18 06:01

【摘要】：硫酸软骨素(Chondroitin sulfate,CS)是由葡萄糖醛酸及N-乙酰半乳糖胺重复二糖单元组成的一种酸性链状多糖,广泛分布于动物组织的细胞外基质和细胞膜表面,主要以蛋白聚糖(PG)的形式存在。研究发现硫酸软骨素具有抗炎、免疫调节、心脑血管保护、抗氧化、调节细胞粘附、抗肿瘤等多种重要生物活性,且长期服用毒副作用小,可以作为保健品和药品广泛使用。目前硫酸软骨素的来源主要是动物软骨组织提取,不同动物组织提取的硫酸软骨素存在分子大小及硫酸化程度差异,且动物提取存在成本高,产量低,环境污染等缺点,希望通过生物化学法合成硫酸化程度及分子量可控的硫酸软骨素类似物。大肠杆菌K4荚膜多糖(Escherichia coli K4 polysaccharide,K4)糖链结构为葡萄糖醛酸与N-乙酰半乳糖胺组成的重复二糖单元,在葡萄糖醛酸C-3上有一个果糖侧链,其与硫酸软骨素具有相同的碳链骨架,可以作为合成硫酸软骨素的前体,本研究通过高密度发酵,对K4多糖发酵液进行分离纯化,得到纯品K4。对K4通过温和的酸水解,去除果糖侧链,得到软骨素类似物去果糖K4(defructosylated K4,K4de),通过NMR、IR、SEC-MALLS、HPLC等手段对其进行结构表征。对得到的K4及K4de,使用对巨噬细胞系研究其的体外免疫调节活性,开发其作为天然的免疫增强剂的潜能。同时对得到的K4de进行不同程度的硫酸化硫酸化,并对硫酸化产物结构进行表征,研究其硫酸化产物的生理活性。研究结果如下:(1)通过高密度生物发酵发酵得到K4de,发酵液中糖醛酸产量达790 mg/L。采用乙醇沉淀法及savage脱蛋白、阴离子交换色谱等方法纯化,得到的K4纯度较高。通过核磁共振及红外对所得K4进行结构表征,通过SEC-MALLS测定其M_w=6.49?10~4,多分散指数PDI为1.05。(2)将不同浓度的K4及去K4de作用于RAW264.7(巨噬细胞),结果表明,K4及K4de对巨噬细胞具有免疫增强活性,能激活巨噬细胞,伸出伪足,刺激巨噬细胞增殖,使NO和相关炎性因子分泌增加,且具有浓度依赖性。(3)通过化学法对分子量为12 kDa的K4de进行降解,制备分子量为3 kDa的L-K4de(低分子量K4de),分别对其进行硫酸化,制备了非定点硫酸化的衍生物K4deOS(H)、K4de-NS、K4de-ONS,及高低两种分子量定点硫酸化的衍生物,分别为K4de-4OS、K4de-6OS、K4de-4.6OS、L-K4de-4OS、L-K4de-6OS、L-K4de-4.6OS,均通过SEC-MALLS测定分子量。并通过琼脂糖凝胶电泳及元素分析表明考察其硫酸化程度,以软骨素酶ABC对硫酸化产物进行酶解,通过HPLC对其进行二糖分析。(4)制备低分子量低程度硫酸化的L-K4deOS(L),作用于CIA模型的关节炎小鼠,考察对小鼠关节炎作用的影响。实验小鼠口服L-K4deOS(L)8周后,与模型组相比,小鼠发病晚,多发性关节炎指数低,且长期服用,小鼠无明显其他不良反应。
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R914;R96
【图文】：

硫酸软骨素,化学结构

Chondroitin sulfate，CS）是一种广泛存在于人类的酸性黏多糖，分布于细胞外基质和细胞膜表面CS 糖链结构是由葡萄糖醛酸（GlcA）和和 N-乙酰成二糖单元，重复二糖单元再以 β-1，4 糖苷键酸基团取代，形成不同种类的硫酸软骨素，CS-A、硫酸软骨素二糖单元如图 1-1，其中，CS-A 是 G代，CS-B 是 GlcA 上 2 位 C 和 GalNAc 上 4 位 CalNAc 上 6 位 C 上的-OH 被取代，CS-D 是 GlcA被硫酸基团取代，而 CS-E 是指 GalNAc 上 4 位和。硫酸软骨素的分子量一般因为其来源的不同，的硫酸软骨素一般为 CS-C，分子大小为 20~25更大，分子量为 50~80 kDa。然而，即使是单一也不均一。此外，CS 的组成和浓度还与来源的洋生物的硫酸软骨素含有不同糖链长度和硫酸化蛙鱼中提取的位 CS-E,从鸡中提取的主要为 CS-

发酵曲线,发酵曲线,野生型,大肠杆菌

图 2-1 野生型大肠杆菌 K4 发酵曲线Fig.2-1 Wild-type E. coli K4 fermentation curve交换色谱法是利用多糖的带电性质不同的将多糖进行分离的方法,K过离子交换色谱法进行进一步分离。K4 粗品使用 AKTA-prime 进行收进行信号采集，洗脱曲线如图 2 所示。纯化过程采用 buffer B 从 0 缓慢洗脱，粗糖分为组分有两个，洗脱峰 1 出峰位置在 buffer B 浓度%，洗脱峰 2 出峰位置在 buffer B 浓度为 50 %~62 %，洗脱峰 2 的组洗脱峰1，分别取两个组分通过紫外吸收光谱进行鉴别，洗脱峰2在2紫外吸收，应该是粗纯化过程中少量残留的蛋白或者核酸 K4 为第一对两个组分进行核磁进一步鉴定。

曲线,梯度洗脱,洗脱峰,曲线

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