响应型靶向抗炎多肽对类风湿性关节炎治疗作用的研究

发布时间：2020-07-18 16:42

【摘要】：研究目的:设计一种集靶向、酶敏感和穿膜等多种功能于一体的多功能抗炎肽,利用固相合成法合成该肽,并通过体外细胞和体内动物实验来对其抗类风湿性关节炎的活性进行评价。研究方法:采用固相合成法,按照四种多肽,即RMTQ、TATQ、QAW和RMT的氨基酸顺序,从C端到N端依次进行合成。利用高效液相色谱(HPLC)对合成多肽的纯度以及利用质谱(MS)对多肽的分子量进行分析;通过圆二色谱仪检查各组多肽的圆二色性,并对其二级结构进行判断;利用Tricine-SDS-PAGE电泳对靶向抗炎多肽的体外酶切实验进行考察;通过CCK-8法对各组多肽对单核巨噬细胞Raw264.7的毒性进行考察;利用脂多糖(LPS)刺激Raw264.7细胞以建立体外细胞炎症模型,细胞上清中的炎症因子IL-6和TNF-α用ELISA试剂盒进行检测;利用试剂盒定量检测细胞内一氧化氮含量,通过荧光显微镜检测细胞内荧光强度来定性检测活性氧含量;利用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜对各组多肽的细胞摄取量分别进行定量和定性的检测和观察;利用荧光探针标记溶酶体的位置,通过激光共聚焦显微镜判断靶向抗炎多肽的溶酶体逃逸情况;通过给小鼠注射完全弗氏佐剂以建立动物炎症模型,建模成功后连续给药14天,与抗炎药物地塞米松,游离多肽QAW、无靶向作用的多肽TATQ和无抗炎活性的多肽RMT进行对比,通过对小鼠的体重、足趾体积、临床关节评分、血清中炎症因子IL-6和TNF-α的含量以及对踝关节腔组织切片的观察等指标的研究,对靶向抗炎多功能肽的体内抗炎活性进行初步评价。研究结果:质谱和高效液相结果表明利用固相合成法合成的多肽分子量正确且纯度能达到98%以上;圆二色谱结果显示除了多肽QAW外,其余三种多肽在室温下水溶液中均为无规则构象;体外酶切实验中,Tricine-SDS-PAGE结果表明靶向抗炎多肽中的酶敏感肽链能被type IV collagenase特异性地剪切。在细胞实验中,CCK-8结果表明各组多肽浓度在不高于30μM时,对Raw264.7细胞的毒性都小于10%;ELISA结果表明,与LPS刺激组、游离多肽QAW组、非靶向TATQ多肽组和无抗炎活性肽RMT组相比,靶向抗炎肽能更有效地降低炎症细胞中炎症因子IL-6和TNF-α的分泌,但治疗效果并不与浓度成正比;在一氧化氮含量的检测中,与其他组相比较,靶向抗炎多肽能显著降低NO的含量;活性氧的定性检测中,靶向抗炎多肽组治疗后活性氧的荧光强度明显低于其他组,但与地塞米松治疗组相当;利用激光共聚焦显微镜对细胞的定性摄取情况的检查结果中,给药1 h时,RMTQ组与TATQ组荧光强度相似,2 h和4 h时,RMTQ组荧光强度渐渐高于TATQ组,且在三个时间点均强于游离抗炎肽QAW,并与流式细胞结果相一致;在对多肽溶酶体逃逸的研究中发现含有穿膜肽的RMTQ组和TATQ组游离溶酶体外的荧光强度明显强于QAW组。动物实验中,与游离抗炎多肽QAW相比,靶向抗炎多肽能更好地降低小鼠炎症关节的肿胀、临床评分及血清中炎症因子的水平,且血液中各种血细胞的含量也更接近于正常组。给药治疗后,各组小鼠的体重都有所增加。实验结论:本实验所设计的多功能靶向抗炎多肽能增加细胞摄取率,提高游离抗炎肽QAW的体内外抗炎活性,具有显著的抗类风湿性关节炎活性和很好的临床治疗前景。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R914;R96
【图文】：

序列,信号通路

图 1.1 NF-κB 信号通路Figure1.1 NF-κB signaling pathway肽代，E. Ruoslahti 首次发现了 RGD 序列（Arg-G细胞附着位点[38]。后来，该序列被认为是天然许多天然蛋白中，如纤维蛋白原，纤连蛋白，应蛋白，凝血酶原，MMP-2，层粘连蛋白，骨合素αvβ3结合[40-42]。在许多肿瘤细胞，血管内皮整合素αvβ3，因此利用 RGD 肽能特异性地结合的纳米药物载体主动地靶向到癌症或炎症部位[4系统而言，靶向制剂最潜在的优势就是能增加向肽连接的载体而言，载体将药物递送到靶部位

靶向,作用机制,类风湿性,前言

靶向抗炎多肽的结构及其作用机制图

高效液相色谱,多肽,谱图,公司

16图 2.1 合成的各多肽的高效液相色谱图（谱图由多肽合成公司提供）（A：RMTQ；B：TATQ；C：QAW；D：RMT）.1 HPLC results of each peptide synthesized by the company (A: RMTQ; B: TAQAW; D: RMT)

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