【摘要】：目的:我们已知右美沙芬是一种临床使用十分广泛而安全的止咳剂,结构上属于吗啡类药物,鉴于其右旋结构,故右美沙芬与阿片类受体亲和力弱,很难形成成瘾性。而既往的研究已经证实通过抑制NOX2活性,减少ROS及其他促炎因子的合成,减少LPS引起的小胶质细胞的活化,右美沙芬具有对抗神经系统炎症反应,预防神经退行性变的作用。同时还可以减轻脓毒症模型下,急性肝衰竭的死亡率但上述研究目标是观察长期神经元的保护效应。而关于右美沙芬在LPS引起的感染急性期病态行为的作用,以及NOX2-/-模型中,观察短期病态行为的研究目前罕有报道。所以我们提出假设右美沙芬是否在LPS诱导的病态行为中通过抑制炎症反应(中枢),达到缓解病态行为的目的。材料与方法:1.(1)分组:野生型(C57BL/6J)小鼠随机分为2组(A组,B组);NOX2基因敲除(Cybb)小鼠随机分为2组(C组,D组)。(2)处理方式:A组.野生型对照组(WT-saline)。B组.野生型内毒素组(WT-LPS)。C组.NOX2基因敲除对照组(Cybb-saline)。D组.NOX2基因敲除内毒素组(Cybb-LPS)。PBS(100ul/20g)及内毒素(2.5mg/kg)均为腹腔内注射。2.病态行为的观察及旷场实验:实验小鼠分别在注射内毒素后每3小时观察一次病态行为学评分,并测量体重变化。主要观测指标:触碰反应,触碰后移动距离,竖毛,眼睑下坠,眼睛分泌物。实验小鼠注射PBS或LPS后9小时,给予病态行为评分后立即进行旷场实验,测量时间20分钟。3.实验小鼠在注射内毒素溶液/PBS溶液后第6,9,12,24小时予以灌流取脑组织,并行免疫组织化学染色(DAB法)。4.ELISA方法测量脑组织的炎症因子蛋白表达水平(IL-1β,IL-6);Real-time PCR测量脑组织的炎症因子基因表达水平(IL-1β,IL-6,TNF-α,MCP-1,iNOS,NOX2,CD-11b)。5.(1)分组:野生型(C57BL/6J)小鼠随机分为4组(A组,B组,C组,D组)。(2)处理方式:A组.野生型对照组(WT-Saline)。B组.野生型内毒素组(WT-LPS)。C组.野生型内毒素联合右美沙芬组(WT-LPS/DM)。D组.野生型右美沙芬组(WT-DM)。PBS(100ul/20g)及内毒素(2.5mg/kg)均为腹腔内注射。DM皮下注射(12.5mg/kg、100uL/20g)。6.病态行为的观察及旷场实验:实验小鼠分别在注射内毒素后每3小时观察一次病态行为学评分,并测量体重变化。主要观测指标:触碰反应,触碰后移动距离,竖毛,眼睑下坠,眼睛分泌物。实验小鼠注射PBS或LPS后9小时,给予病态行为评分后立即进行旷场实验,测量时间20分钟。7.实验小鼠在注射内毒素溶液/PBS溶液后第6,9,12,24小时予以灌流取脑组织,并行免疫组织化学染色(DAB法)。ELISA方法测量脑组织的炎症因子蛋白表达水平(IL-1β,IL-6,TNF-α);Real-time PCR测量脑组织的炎症因子基因表达水平(IL-1β,IL-6,TNF-α,MCP-1,iNOS,NOX2,CD-11b)。结果:1.野生型小鼠及NOX2~(-/-)小鼠均接受LPS的腹腔注射后,分别从3小时开始到24小时结束每3小时观察一次,两组小鼠都可观察到病态行为,而且均是从3小时开始逐渐加重,直至15小时,病态行为达到最严重的程度。随后病态行为逐渐减轻,但直至24小时,两组小鼠仍存留不同程度的病态行为。其中NOX2~(-/-)小鼠表现出的病态行为较野生型小鼠的病态行为轻微,而在注射LPS后的第9,12,15小时,NOX_2~(-/-)小鼠的病态行为评分低于WT小鼠的病态行为,两组差异有统计学意义(p0.05)。而旷场实验中,NOX_2~(-/-)小鼠在第9小时的各项指标高于WT小鼠在第9小时的各项指标(总活动次数506.6±206.7 vs 293.5±183.6;走动次数437.8±184.2 vs 313±210.8;总活动时间138.3±56.6s vs 71.9±43.5s;移动距离681.2±237.2cm vs 252.4±170.3cm),两组差异有统计学意义(p0.05)。2.野生型小鼠及NOX2~(-/-)小鼠均接受LPS的腹腔注射后,前者黑质纹状体部位的小胶质细胞出现可活化的迹象,通过CD11b的染色可以观察到,小胶质细胞形状体积的增大,触角的增多,染色深染;对比野生型小鼠,NOX2~(-/-)小鼠黑质纹状体部位的小胶质细胞活化不甚明显,细胞体积较WT-LPS组明显缩小,细胞分叉减少,染色较WT-LPS浅淡,同时与NOX2~(-/-)注射生理盐水组对比,NOX2~(-/-)注射LPS的小鼠的小胶质细胞并且显示出激活的迹象。同时我们还分析了两组小鼠分别给LPS后脑内炎症介质(IL-1β及IL-6)的时间变化规律,发现NOX2~(-/-)小鼠注射LPS后中枢神经系统产生的IL-1β及IL-6均较野生型小鼠注射LPS后中枢神经系统产生的IL-1β及IL-6水平降低(IL-1β:29.58±4.9 pg/ml vs 40.17±3.22pg/ml;IL-6:19.2±2.1 pg/ml vs 25.93±2.61 pg/ml)(p0.05)。3.腹腔注射LPS后,分次皮下注射右美沙芬后(LPS注射后3小时,6小时,9小时),每3小时观察一次病态行为。单纯注射LPS组的小鼠,其病态行为评分从第3小时开始,随时间的推移逐渐增加,直至注射LPS后的第15小时,病态行为评分达到最高,此后逐渐下降,至24小时,仍存在一定程度的病态行为。与之相比,注射LPS及右美沙芬组的小鼠,其病态行为随时间推移,其升高的程度较单纯注射LPS组小鼠,表现轻微;尤其是在第6小时,第9小时及第15小时三个时间点,两组之间的病态行为评分差异具有统计学意义(p0.05)。而旷场实验中,LPS联合DM组小鼠在第9小时的各项指标高于单纯LPS处理组小鼠在第9小时的各项指标(总活动次数785±194 vs 340±91;走动次数711±168vs 294±78;总活动时间194±39.8s vs 60±10.7s;移动距离833±179cm vs332±96.4cm),两组差异有统计学意义(p0.05)。4.我们通过ELISA方法连续测定(注射LPS后的第3小时,第6小时及第9小时)小鼠脑组织内的IL-1β,IL-6及TNF-α的含量。发现在腹腔注射LPS后的第9小时(即第三次皮下注射右美沙芬时间点),测定两组小鼠脑组织内的IL-1β及IL-6的含量(单纯LPS组及LPS联合右美沙芬组)有差异。联合注射LPS及右美沙芬组的小鼠脑组织内第9小时的IL-1β及IL-6水平比单纯注射LPS小鼠脑组织内第9小时的IL-1β,IL-6水平降低(IL-1β:39.41±4.3pg/ml vs 50.73±1.82pg/ml;IL-6:17.9±2.67pg/ml vs 24.7±2.20pg/ml)(p0.05);同时我们通过免疫组化染色还发现,腹腔注射LPS后的第24小时,单纯腹腔注射LPS的小鼠,脑组织内黑质纹状体处的小胶质细胞活化程度明显,呈现出体积增大,伪足增多,胞内染色深染(CD11b)的表现;而联合注射LPS及右美沙芬组的小鼠,在第24小时,脑组织内黑质纹状体处的小胶质细胞染色发现,小胶质细胞体积增大较前者减弱,伪足数量较单纯注射LPS组小鼠减少,同时CD11b的染色较单纯注射LPS组小鼠轻微。结论:NOX2~(-/-)模型中,腹腔注射LPS后引起的短期病态行为比野生型小鼠的病态行为轻微,提示NOX2~(-/-)可以减轻腹腔注射LPS引起的小鼠的病态行为;同时使用NOX2的抑制剂右美沙芬,可以通过减轻中枢炎症反应(降低IL-1β,IL-6水平),达到缓解病态行为的作用。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R965
【图文】：
天津医科大学博士学位论文 二、NOX2 在内毒素诱导的中枢系统炎症中的组（Cybb-LPS）6 小时时间点，9 小时时间点，12 小时时间点 IL-1β 分别(55.02±3.34 pg/ml, 29.58±4.9 pg/ml, 34.98±3.54 pg/ml, p<0.0001)(图 2.3 A)。9时间点，四组之间差异有统计学意义，F9h(3,36)=38.47, p<0.001，WT 小鼠LPS 后，IL-1β 较对照组上升；但是 NOX2-/-内毒素组产生的 IL-1β 比野生型素组产生的 IL-1β 降低（B 组：40.17±3.22 pg/ml， D 组：29.58±4.9 pq=5.133,p=0.028）。提示注射 LPS 后，Cybb （NOX2-/-）可以减少 IL-β 的产（图 2.3 B）AB
天津医科大学博士学位论文 四、右美沙芬在内毒素诱导的 CNS 炎p<0.0001)。D 组. 野生型右美沙芬组（WT-DM）6 小时时间点，9 小12 小时时间点 IL-1β 分别为：(10.36±1.6pg/ml, 12.59±2.24 pg/ml, 1pg/ml, p=0.434)。(图 4.3 A)。9 小时时间点，四组之间差异有统计F9h(3,36)=46.39, p<0.001；其中 C 组 IL-1β 水平低于 B 组(B 组：50.73 ±C 组：39.41±4.3 pg/ml, q=4.077,p=0.013)。提示 WT 小鼠注射 LPS 后 9 较对照组上升；而 LPS 联合 DM 组产生的 IL-1β，比单纯 LPS 组产减低。(图 4.3 B)。A B
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2761428
