咖啡酸邻硝基苯乙酯抗大鼠MIRI作用及其心脏代谢物分析

发布时间：2020-07-18 22:38

【摘要】：冠状动脉血流量降低,心肌血液供应受阻,导致心肌缺血,使心肌细胞供氧不足和代谢产物清除减少,造成心脏功能障碍甚至心肌细胞死亡。缺血后的血流恢复或输血反而可能加重心肌组织结构和功能破坏、甚至发生不可逆性损伤,造成心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI)。钙超载和活性氧增多引起的氧化应激、炎症反应、心肌纤维化与凋亡是MIRI主要的发病机制,研究改善这些病因的药物对抗MIRI具有积极的临床意义。咖啡酸苯乙酯(CAPE)是提取自蜂胶中的一种活性成分,属类黄酮类,有较好的抗氧化、抗炎、抗菌、抗肿瘤等药理活性。有报道类黄酮类物质如姜黄素可以通过上调沉默信息调节因子1(SIRT1)的表达,增加抗氧化能力起到改善MIRI作用,而同属黄酮类的CAPE是否能够激活SIRT1还未见报道。本课题组在CAPE的苯环对位引入硝基合成的咖啡酸对硝基苯乙酯(CAPE-pNO_2)具有更强的促巨噬细胞的吞噬、抗血小板聚集、改善MIRI与糖尿病肾病损伤的作用。前期的研究表明硝基引入能增加MIRI的心肌组织中NO的含量,增加的NO是由硝基取代化合物直接代谢还是通过上调一氧化氮合酶(eNOS)加速生成而来还需进一步验证。本试验首次合成了CAPE的邻位硝基取代物——咖啡酸邻硝基苯乙酯(CAPE-oNO_2),并申报获得了中国发明专利。SYBYL模拟发现,邻位取代较对位取代具有更高的溶解度和更低的脏器毒性。本文选择CAPE-oNO_2通过动物实验和细胞实验进一步探讨其对大鼠急性MIRI的作用及其可能的作用机制。动物实验:结扎SD大鼠左冠状动脉前降支造成心肌缺血,缺血30 min后再灌注2 h建立急性MIRI模型。结扎前30 min尾静脉注射给予SIRT1抑制剂烟酰胺(NAM)或eNOS抑制剂N-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME),而药物或溶剂(Vehicle)在结扎前15 min给予。将大鼠随机分为8组:空白对照(Control)组,缺血再灌注(IR)组,CAPE(0.1 mg/kg)组,CAPE-oNO_2(0.1 mg/kg)组,NAM(1 mg/kg)+Vehicle组,NAM(1 mg/kg)+CAPE-oNO_2(0.1 mg/kg)组,L-NAME(1 mg/kg)+Vehicle组,L-NAME(1 mg/kg)+CAPE-oNO_2(0.1 mg/kg)组。首先通过TTC、HE、免疫组化和天狼星红染色分别测定心肌梗死面积、心脏组织病理学变化、心脏组织中TNF-α表达和胶原含量,再用试剂盒测定血清中心肌酶(HBDH,LDH,CK,CK-MB和IMA)水平与心脏组织中t-SOD、MDA、MPO、NO含量,然后通过免疫印迹(Western blot)法分析心肌组织中相关蛋白的表达。最后通过LC-MS方法分析CAPE和CAPE-oNO_2在MIRI大鼠心肌组织中的代谢情况。结果表明,CAPE和CAPE-oNO_2均可降低心肌梗死面积,改善缺血引起的心肌细胞排列紊乱,炎性细胞聚集等现象,并且能够显著降低心肌酶、MDA、MPO含量,TNF-α表达和胶原沉积,增加t-SOD活性和NO含量(P0.05)。两者均可上调SIRT1和eNOS的表达,从而影响下游信号通路NF-κB,通过激活PGC-1α/Nrf2/SOD1系统缓解氧化应激;通过抑制IκB和P65磷酸化,下调TNF-α与IL-6表达,减少心肌组织炎症反应;通过下调TGF-β1,p-Smad2/3和Collagen的表达,减少心肌胶原沉积;通过上调Bcl-2和下调Bax的表达,减少心肌细胞的凋亡。值得注意的是CAPE-oNO_2在抗氧化、抗炎症反应、抗纤维化和抗凋亡方面均表现出较CAPE更强的作用(P0.05),而当给予抑制剂后CAPE-oNO_2改善MIRI的作用被明显抑制。二者的代谢产物与代谢方式均存在明显差异,CAPE-oNO_2具有脱硝基代谢方式。细胞实验,采用氧糖剥夺的培养方法诱导H9c2心肌细胞缺氧,2h后正常条件下培养4h以复氧,建立细胞层面的MIRI模型。抑制剂在缺氧初期给予而药物或溶剂在复氧初期给予。取对数期细胞分为10组:Control组,缺氧/复氧(HR)模型组,CAPE(10,20,40μM)组,CAPE-oNO_2(10,20,40μM)组,NAM(40μM)+CAPE-oNO_2(40μM)组,L-NAME(40μM)+CAPE-oNO_2(40μM)组。通过噻唑蓝(MTT)实验测定心肌细胞的存活率,AO染色和ROS染色分别考察细胞凋亡情况和细胞内活性氧水平。结果显示,HR处理后心肌细胞存活率明显降低(P0.05),而给予CAPE和CAPE-oNO_2能有效提高细胞存活率,减少HR诱导的细胞凋亡和ROS产生,并且呈现剂量依赖性。Western blot结果显示CAPE和CAPE-oNO_2组较HR组的SIRT1,eNOS,PGC-1α,SOD1和Bcl-2蛋白表达明显增加,而p-IκB/IκB,p-P65/P65和Bax明显降低(P0.05)。同样地,在细胞层面CAPE-oNO_2仍然表现出比CAPE更强抗MIRI的作用,而抑制剂的存在则一定程度上削弱了CAPE-oNO_2的作用。动物和细胞实验均显示,CAPE和CAPE-oNO_2能够有效缓解MIRI,可能成为临床改善和预防心肌损伤的候选药物。其作用机制可能为增加SIRT1和eNOS蛋白表达,影响NF-κB下游信号通路,产生抗氧化应激、抗炎症反应,抗潜在纤维化和抗凋亡的作用,通过多向调节发挥心肌保护作用。硝基取代能够明显提高CAPE的抗MIRI活性,其原因可能在于更大程度地上调SIRT1和eNOS从而影响NO含量并可能通过直接脱硝基代谢出NO,CAPE和CAPE-oNO_2在心脏组织中的不同代谢产物与方式也可能是CAPE-oNO_2效果优于CAPE的原因之一。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R965
【图文】：

心肌缺血再灌注损伤,病理机制

第 1 章文献综述方面由于纤维化心肌组织的电传导异常阻碍了心肌细胞对氧的摄取，可恶性心律失常的发生，甚至猝死[12]。ROS 是心肌纤维化形成与发展的关研究表明，ROS 在心脏成纤维细胞增殖、胶原合成和细胞外基质代谢过要作用。正常情况下，心肌间质胶原处于动态平衡状态，以此来保持细的稳定。ROS 可通过使细胞外基质蛋白的降解增加，从而激活基质金属（MMP-2）和 MMP-9 等途径，调节成纤维细胞增生，促进 MF。此外 R通过激活相关信号通路，介导心肌细胞的肥大、凋亡，同时通过灭活 N血管内皮功能的紊乱，进而诱发或加重 MF 的发生[13]。

结构式

图 3.1 CAPE，CAPE-pNO2和 CAPE-oNO2的结构式Fig 3.1 The chemical structure of CAPE，CAPE-pNO2and CAPE-oNO2.3.2.2 合成方法咖啡酸邻硝基苯乙酯合成路线如图 3.2 所示。将咖啡酸 0.9 g（5.0 mmol，Ⅰ）和二氯亚砜 20 ml 置 100 ml 圆底烧瓶中，混匀，升温至 80 ℃回流反应，待反应液变为澄清后，减压蒸馏除去剩余的二氯亚砜，得到乳白色固体咖啡酸酰氯（Ⅱ），加入无水二氯甲烷（氢化钙干燥）20 ml 使溶解，在室温条件下滴加邻硝基苯乙醇0.8 g（4.8 mmol，Ⅲ）的二氯甲烷溶液 20 ml，混合均匀后，再滴加三乙胺 0.4 ml（2.9 mmol），升温至 50 ℃回流反应，用薄层色谱法监测反应进程，反应完毕后，将反应液减压蒸馏除去溶剂得到浅黄棕色粘稠液体，用适量无水丙酮溶解后，加入 80-100 目硅胶搅拌混匀，再减压蒸馏除去丙酮后，用柱层析（硅胶 200-300 目）分离纯化，干法上样，丙酮-石油醚（体积比 1:3）混合溶剂为洗脱剂，收集洗脱液，真空旋蒸干燥，得棕褐色固体，用丙酮-石油醚混合溶剂重结晶，得浅黄棕色晶体。

高效液相色谱法,质谱,液质联用,咖啡酸

21图 3.3 高效液相色谱法结果Fig 3.3 The results of HPLC. (A)The HPLC results of caffee acid. (B) The HPLC results ofo-nitrophenylethanol. (C) The HPLC results of CAPE-oNO2.(D) The HPLC results of CAPE.3.3.5 液质联用质谱咖啡酸邻硝基苯乙酯的质谱（图 3.4）为：LC-MS m/z (%):328.0724[M-H] + (calc.C17H15NO6: 329.02)。

【参考文献】