Cytisine-Pterocarpan新骨架化合物的仿生合成及抗肿瘤机制研究

发布时间：2020-07-19 12:04

【摘要】：山豆根是最初记载于《开宝本草》的一种中药,前期对山豆根的研究发现其中含有Cytisine-Pterocarpan新骨架化合物,而该类型化合物具有一定的抗肿瘤活性。但是Cytisine-Pterocarpan新骨架化合物在山豆根中的含量较低,且提取收率低,所以如何大量得到该类型化合物已成为当务之急。本课题对Cytisine-Pterocarpan新骨架化合物的仿生合成方法进行研究,为该类型化合物的深入研究奠定物质基础,后续对该类型化合物的抑制肿瘤活性和选择性进行评价,并对其抗肿瘤机制进行研究,期望发现新的前体化合物或候选药物。目的和意义:通过前期工作,我们发现Cytisine-Pterocarpan新骨架化合物对乳腺癌细胞的生长具有一定的抑制作用,研究采用仿生合成的方法来构建合成路线短、反应条件温和、操作简单、收率高的合成工艺,并通过体外活性测定方法来评价其抗肿瘤活性,进而对其抗肿瘤机制进行深入研究。研究方法:首先对Cytisine-Pterocarpan新骨架化合物进行仿生合成,并对合成工艺条件进行优化;通过MTT法测定Tonkinensine B对不同肿瘤细胞的抑制活性,计算其IC_(50),确定Tonkinensine B的有效浓度;使用Hoechst33342染色法观察Tonkinensine B引起MDA-MB-231细胞凋亡的形态变化;通过细胞流式技术研究Tonkinensine B促进MDA-MB-231细胞凋亡的作用;使用Western Blot测定MDA-MB-231细胞的内源性细胞凋亡途径中Bcl-2、Bax、Cytochrome C蛋白的表达量,从而确定Tonkinensine B对三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞中关键蛋白表达的影响。研究成果:本实验以N,N-4-二甲基-4-氨基吡啶(DMAP)为催化剂,以(-)-Cytisine和(-)-Maackiain为底物,在HCHO的存在下以温和方式合成了Cytisine-Pterocarpan新骨架化合物,并通过优化反应条件,构建了较优的合成工艺。对(-)-Cytisine、(-)-Maackiain和Tonkinensine B进行体外细胞毒性测定,测定的细胞株包括MCF-7、MDA-MB-231、3LL、9L、Raw264.7、BV2,研究发现Cytisine-Pterocarpan新骨架化合物对乳腺癌细胞的生长具有一定的抑制作用,尤其是对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的毒性较明显(IC_(50)=19.2μM)。Cytisine-Pterocarpan新骨架化合物对正常的免疫细胞Raw264.7和BV2细胞的毒性数据表明该类化合物对中枢神经系统具有低的细胞毒副作用;细胞流式实验数据表明Cytisine-Pterocarpan新骨架化合物促进MDA-MB-231细胞凋亡是发生在细胞凋亡的晚期;Western Blot实验数据表明该类化合物可调控MDA-MB-231细胞中Bcl-2、Bax、Cytochrome C蛋白的表达。所得结论:我们用仿生合成的方法将(-)-Cytisine和(-)-Maackiain偶联合成Cytisine-Pterocarpan新骨架化合物,该类化合物能够有效地降低三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的活性,加速细胞的凋亡,并且细胞凋亡是通过线粒体介导的细胞凋亡途径,其具体机制是通过上调Bax/Bcl-2蛋白的比值,促进Cytochrome C从线粒体向细胞质释放,最终促进细胞凋亡。学术意义与应用前景:乳腺癌是当今临床上常见的一种恶性肿瘤,据统计我国乳腺癌的发病率已经成为女性肿瘤的首位。随着现代免疫学和细胞分子生物学的快速发展,人们对乳腺癌细胞凋亡通路中信号的转导有了深入了解,人体通过细胞凋亡这一生理过程能够有效的抑制肿瘤细胞的生长,因此恶性肿瘤的治疗方法主要是以诱导肿瘤细胞发生凋亡来遏制肿瘤的生长。本课题通过采用仿生合成的方法得到Cytisine-Pterocarpan新骨架化合物,对其抗肿瘤生物活性进行筛选,发现其对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231具有较为明显的毒性作用,我们应用现代生物学技术和分子生物学手段,考察Cytisine-Pterocarpan新骨架化合物对MDA-MB-231细胞的生长抑制作用,探讨其促进MDA-MB-21细胞凋亡通路的分子机制,未来有利于阐明乳腺癌的具体发病机制,为开发新的乳腺癌治疗药物提供更多的理论依据。
【学位授予单位】：浙江工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R914;R96
【图文】：

化学结构式

23]，进一步表明金雀花碱在化学合成以及药物研发方面的重要性。图1-1 (-)-Cytisine的化学结构式Figure 1-1. Structures of (-)-Cytisine1.1.3 Pterocarpan 的概述Pterocarpan 属于异黄酮类化合物，中文名叫“紫檀素”，从 1874 年第一个紫檀素类化合物被分离得到以后，其一直是研究的热点。(-)-Maackiain 属于异黄酮类化合物，中文名字为“高丽槐素”，又名马卡因，其化学结构如图 1-2。高丽槐素广泛存在于红车轴草[25]、牛大力、锦鸡儿[26]等植物中，其中红车轴草是一种全国范围内广泛分布的天然植物，多分布在草原或绿洲地区，尤其在新疆地区最为常见。通过对文献的收集整理发现，高丽槐素能够有效地抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和谷草芽孢杆菌的分裂生长，具有很好的抗真菌和抗细菌功效[27]

化学结构式

进一步表明紫檀类化合物在药物研发方面的重要性。图1-2 (-)-Maackiain的化学结构式Figure 1-2. Structures of (-)-Maackiain1.1.4 Cytisine-Pterocarpan 新骨架化合物的概述(-)-Cytisine 和 Pterocarpan 这两种类型的化合物在药物研发领域一直为研究者所关注，但是具有 Cytisine-Pterocarpan 偶联骨架的化合物还是首次被发现[38]。其中具有 Cytisine-Pterocarpan 新骨架化合物的两个化合物 Tonkinensine A 和Tonkinensine B 是山豆根中含量较低的化合物，前期对它们的抗肿瘤活性进行了初步的研究，发现 Tonkinensine B 对人类宫颈癌 HeLa 细胞和人三阴性乳腺癌MDA-MB-231 细胞具有一定的生长抑制作用，所以有必要对具有该新骨架类型化合物的发现、合成以及生物活性进行深入的研究。图1-3 Cytisine-Pterocarpan新骨架化合物的化学结构式Figure 1-3. Structures of Cytisine-Pterocarpan derived compounds1.2 研究目的随着对中药成分的活性筛选、细胞分子生物学等技术的不断深入研究，从自然界常见的植物中研究开发出高效低毒的肿瘤治疗药物或先导化合物已经成为开展新型抗癌药物的一个重要的途径。自然界中存在的植物种类多样，来源不同的植物其所含的成分也存在很大的差异，该性质造成了不同天然植物中有效成分的千差万别

化学结构式,化合物,三阴

图1-2 (-)-Maackiain的化学结构式Figure 1-2. Structures of (-)-Maackiain1.1.4 Cytisine-Pterocarpan 新骨架化合物的概述(-)-Cytisine 和 Pterocarpan 这两种类型的化合物在药物研发领域一直为研究者所关注，但是具有 Cytisine-Pterocarpan 偶联骨架的化合物还是首次被发现[38]。其中具有 Cytisine-Pterocarpan 新骨架化合物的两个化合物 Tonkinensine A 和Tonkinensine B 是山豆根中含量较低的化合物，前期对它们的抗肿瘤活性进行了初步的研究，发现 Tonkinensine B 对人类宫颈癌 HeLa 细胞和人三阴性乳腺癌MDA-MB-231 细胞具有一定的生长抑制作用，所以有必要对具有该新骨架类型化合物的发现、合成以及生物活性进行深入的研究。

【参考文献】