阿霉素与棕榈酰化抑制剂溴代十六烷酸联合应用抑制骨肉瘤细胞的作用及机制研究

发布时间：2020-07-19 15:41

【摘要】：研究背景:骨肉瘤(Osteosarcoma)是原发性恶性肿瘤中最常见的一种骨肿瘤,常发于儿童与青少年。自上世纪70年代起,临床上骨肉瘤的治疗方案主要是截肢手术配合新辅助化疗,其中化疗的一线用药为阿霉素、甲氨蝶呤、顺铂、异环磷酰胺等,患者五年生存率约65%-70%。然而近几十年来,骨肉瘤的治疗一直停滞不前,患者的五年生存率未见提高,亟待寻找新的化疗方案。阿霉素(Adriamycin,ADR)对骨肉瘤有良好的疗效,主要通过破坏DNA三级结构并促进细胞产生氧化应激从而达到治疗目的。但是阿霉素极易在心肌细胞蓄积,导致严重的心脏毒性。此外,一定数量的患者在接受阿霉素辅助治疗后存在复发、转移以及原发或继发性耐药现象,限制了阿霉素在临床上更广泛的应用。因此,如何基于阿霉素对骨肉瘤的治疗方案进行新的探索,是目前亟需解决的问题。蛋白质棕榈酰化修饰是一种最普遍的翻译后脂质修饰形式,包括不可逆型N-棕榈酰化和可逆型S-棕榈酰化。S-棕榈酰化指饱和的含16个碳的棕榈酸通过硫脂键与蛋白质半胱氨酸残基共价结合的过程,可由DHHC蛋白介导。近年来,大量研究发现,棕榈酰化与癌症的发生发展密切相关。抑制与癌症相关的蛋白棕榈酰化能够有效治疗肿瘤。因此,本课题拟通过实验研究蛋白棕榈酰化抑制剂溴代十六烷酸(2-Bromopalmitate,2-BP)与阿霉素(Adriamycin,ADR)联合应用,诱导骨肉瘤细胞凋亡的效应,并进一步探讨其内在的分子机制。研究目的:本研究的目的是探讨棕榈酰化抑制剂2-Bromopalmitate(2-BP)对阿霉素(ADR)抗骨肉瘤作用的影响,并进一步阐明其内在的分子机制。具体分为两部分:1)验证棕榈酰化抑制剂2-BP协同阿霉素治疗骨肉瘤的效果。2)阐明活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)诱导的内质网应激在2-BP协同阿霉素诱导骨肉瘤细胞凋亡中的作用,探究两药联合应用后内质网应激下游信号的变化。研究方法:选用人骨肉瘤细胞株(U20S和MG63)与骨肉瘤病人的原代细胞样本(OS14、OS15、OS20和OS21)为主要研究对象,考察2-BP与ADR联合应用对骨肉瘤细胞的增殖及凋亡的影响。采用磺酰罗丹明B(Sulforhodamine B,SRB)法检测骨肉瘤细胞增殖情况;采用碘化丙唆(Propidium Iodide,PI)单染法结合流式细胞术检测细胞死亡比例;采用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(Diamidino-2-Phenylindole,DAPI)染色法观察细胞凋亡情况;采用膜联蛋白V/碘化丙啶(Annexin V/PI)双染法结合流式细胞术检测细胞凋亡比例;采用蛋白质印迹法(Western Blot)检测细胞凋亡相关蛋白聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶(Poly-ADP-Ribose Polymerase,PARP)、Caspase 8、Caspase 3的裂解情况;加入不同的细胞程序性死亡抑制剂后,采用PI单染法结合流式细胞术检测骨肉瘤细胞死亡比例,并结合Western Blot观察细胞凋亡相关蛋白的裂解变化,进一步探究加入细胞程序性死亡抑制剂后各组细胞凋亡变化情况。选用人骨肉瘤细胞株U20S和骨肉瘤病人的原代细胞样本OS21为主要研究对象,考察2-BP协同ADR诱导骨肉瘤细胞凋亡的分子机制。采用PI单染法结合流式细胞术检测细胞周期分布;采用Western Blot检测细胞DNA损伤应答相关蛋白ATM、ATR、CHK1和CHK2的磷酸化水平;加入活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)清除剂 N-乙酰-L-半胱氨酸(N-Acetyl-L-Cysteine,NAC)和 L-谷胱甘肽(L-Glutathione,GSH)后采用PI单染法结合流式细胞术检测骨肉瘤细胞周期分布变化;采用荧光探针二氯二氢荧光素乙酰乙酸(Carboxy-Dichlorofluorescein Acetic Acid,Carboxy-DCFDA)结合流式细胞术检测细胞活性氧水平;加入内质网应激诱导剂衣霉素(Tunicamycin,Tu)后采用PI单染法结合流式细胞术检测细胞死亡比例变化;采用Western Blot和半定量PCR分别检测细胞内质网应激下游信号激活转录因子4(Activation Transcription Factor 4,ATF4)、激活转录因子 6(Activation Transcription Factor 6,ATF6)和 X 盒结合蛋白 1(X-box Binding Protein 1,XBP1)的表达水平;采用实时定量PCR法检测CCAAT增强子结合蛋白的同源蛋白(CCAAT-enhancer-binding Protein Homologous Protein,CHOP)mRNA的表达水平;采用Western Blot检测CHOP蛋白表达水平;加入ROS清除剂后采用Western Blot检测CHOP蛋白表达水平变化;用siCHOPs转染后,采用实时定量PCR法检测CHOP mRNA的表达水平验证沉默效率,再采用PI单染法结合流式细胞术检测细胞周期分布变化,并采用AV/PI双染法结合流式细胞术检测细胞凋亡比例;采用Western Blot检测沉默CHOP后细胞凋亡相关蛋白蛋白PARP、Caspase 8、Caspase 3的裂解变化情况。研究结果:1)2-BP协同ADR引起骨肉瘤细胞增殖抑制,诱导细胞凋亡2-BP可以增强ADR抑制骨肉瘤细胞和人源骨肉瘤原代细胞增殖的能力,且呈良好的浓度关系;各浓度合用指数(Combination Index,CI)均小于1;同时,2-BP能够有效降低骨肉瘤细胞和人源骨肉瘤原代细胞上阿霉素的IC50。PI单染法结合流式细胞术和AV-PI双染法结合流式细胞术实验结果提示2-BP与ADR联合应用可上调细胞凋亡比例;DAPI染色后可观察到合用组引起的细胞核的破碎以及凋亡小体的数量均多于单用组;Western Blot结果显示,合用组能够明显增加细胞凋亡相关蛋白PARP、Caspase 8、Caspase 3的裂解,且呈浓度相关;此外,细胞凋亡抑制剂能够逆转2-BP协同ADR诱导骨肉瘤细胞发生凋亡。2)2-BP协同阿霉素诱导的细胞凋亡与活性氧产生相关首先,2-BP未能显著增强阿霉素诱导的骨肉瘤细胞周期阻滞效果;与单用组相比,ADR和2-BP合用组DNA损伤应答相关蛋白ATM、CHK1、ATR和CHK2的磷酸化水平没有明显提高。上述结果提示2-BP协同ADR诱导骨肉瘤细胞发生凋亡与DNA损伤的机制没有明显相关。另一方面,在骨肉瘤细胞株和人源骨肉瘤原代细胞上,ROS清除剂NAC和GSH均能有效缓解两药合用诱导的细胞凋亡;检测细胞活性氧水平发现ADR单用组ROS水平有一定提高,但是ADR与2-BP合用组的ROS水平与其相比未有明显上调。3)2-BP协同阿霉素激活内质网应激下游CHOP信号内质网应激诱导剂衣霉素(Tunicamycin,Tu)能够加重ADR、2-BP以及两者合用诱导的细胞凋亡;另一方面,2-BP对ADR诱导细胞凋亡的协同效果比其协同Tu的效果更明显。检测未折叠蛋白反应(Unfolded Protein Response,UPR)下游信号ATF4,ATF6和XBP1表达水平发现,2-BP能够增强ADR上调ATF4蛋白表达水平的能力,而ATF6和XBP1的表达水平在给药前后无明显差别。2-BP与ADR联合应用能够显著上调CHOP的转录表达水平,且呈作用时间依赖性和浓度依赖性;同时,两药合用也能显著上调CHOP蛋白表达水平;加入ROS清除剂NAC后,ADR与2-BP合用导致的CHOP蛋白表达水平的上调被明显抑制;此外,沉默CHOP蛋白表达能够逆转2-BP协同阿霉素诱导的细胞凋亡:PI单染法结合流式细胞术和AV-PI双染法结合流式细胞术军检测到合用组细胞凋亡比例降低,而且细胞凋亡相关蛋白PARP、Caspase 8、Caspase 3的裂解被明显削弱。研究结论:本研究发现了蛋白质棕榈慥化抑制剂2-溴代十六烷酸(2-Bromopalmitate,2-BP)能够增强阿霉素对骨肉瘤细胞的增殖抑制作用,并阐明了活性氧诱导的CHOP信号活化在2-BP协同阿霉素诱导骨肉瘤细胞凋亡中起关键作用。本研究首次提出了 2-BP与阿霉素联合应用具有良好的抗骨肉瘤疗效,为临床治疗骨肉瘤提供了一种新思路。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R96
【图文】：

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浙江大学硕士学位论文逦实验结果逡逑细胞株Ｕ２０Ｓ和ＭＧ６３上，２－ＢＰ对阿霉素的抗肿瘤活性的影响。取对数生长期的逡逑骨肉瘤细胞株Ｕ２０Ｓ和ＭＧ６３接种于９６孔板，分别给予梯度浓度的阿霉素、２－ＢＰ逡逑以及两药合用，作用４８小时后采用ＳＲＢ法检测各组的增殖抑制作用。图４．１．２逡逑的结果显示，在２－ＢＰ邋（１２．５邋和２５邋ｐＭ）的作用下，ＡＤＲ对Ｕ２０Ｓ的ＩＣ５0由逡逑０．９５邋｜ｘＭ邋降低至邋０．３６邋（ａＭ邋和邋０．２５邋ｐＭ；在邋２－ＢＰ邋（２０邋｜ｉＭ邋和邋２５邋（ｉＭ）的作用下，ＡＤＲ逡逑对ＭＧ６３的ＩＣ５０由０．４６邋降低至０．１６邋｜ｕＭ和０．１０邋ＭＭ。因此我们的实验结果提逡逑示，２－ＢＰ能够明显增强阿霉素对骨肉瘤细胞株的增殖抑制作用。逡逑Ｕ２０Ｓ逦ＭＧ６３逡逑

细胞株Ｕ２０Ｓ和ＭＧ６３上，２－ＢＰ对阿霉素的抗肿瘤活性的影响。取对数生长期的逡逑骨肉瘤细胞株Ｕ２０Ｓ和ＭＧ６３接种于９６孔板，分别给予梯度浓度的阿霉素、２－ＢＰ逡逑以及两药合用，作用４８小时后采用ＳＲＢ法检测各组的增殖抑制作用。图４．１．２逡逑的结果显示，在２－ＢＰ邋（１２．５邋和２５邋ｐＭ）的作用下，ＡＤＲ对Ｕ２０Ｓ的ＩＣ５0由逡逑０．９５邋｜ｘＭ邋降低至邋０．３６邋（ａＭ邋和邋０．２５邋ｐＭ；在邋２－ＢＰ邋（２０邋｜ｉＭ邋和邋２５邋（ｉＭ）的作用下，ＡＤＲ逡逑对ＭＧ６３的ＩＣ５０由０．４６邋降低至０．１６邋｜ｕＭ和０．１０邋ＭＭ。因此我们的实验结果提逡逑示，２－ＢＰ能够明显增强阿霉素对骨肉瘤细胞株的增殖抑制作用。逡逑Ｕ２０Ｓ逦ＭＧ６３逡逑ＡＤＲ（（ｊＭ）邋０逦０．４逦０．８逦１．２逦１．６邋ＡＤＲ邋（ｐＭ）邋０逦０．１逦０．２邋０．３邋０．４邋０．５逡逑图４．１．２邋２－ＢＰ增强阿霉素对骨肉瘤细胞的增殖抑制作用逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋４．１．２邋２－Ｂｒｏｍｏｐａｌｍｉｔａｔｅ邋ｅｎｈａｎｃｅｄ邋ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ邋ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｃｅｉｌ邋ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ逡逑ｉｎ邋ｈｕｍａｎ邋ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ邋ｃｅｌｌ邋ｌｉｎｅｓ．邋Ｕ２０Ｓ邋ｃｅｌｌｓ邋ｗｅｒｅ邋ｅｘｐｏｓｅｄ邋ｔｏ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ邋ｏｆ逡逑２－ｂｒｏｍｏｐａｌｍｉｔａｔｅ邋（０

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本文编号：2762616