Ⅲ类羊毛硫肽合成酶中裂解功能域的活性研究

发布时间：2020-07-19 18:16

【摘要】：Ⅲ类羊毛硫肽类化合物是RiPPs家族中一类重要的天然产物,在其生物合成过程中,III类合成酶LanKC对前体肽进行脱水环化等一系列修饰,最后形成具有生物活性的成熟RiPPs。LanKC是一个三功能合成酶修饰,带有一个N-端裂解酶结构域,一个中心激酶结构域和一个推定的C-末端环化酶结构域。序列分析发现LanKC的N-端区域(LanKC-lyase)和OspF家族蛋白具有较高的序列相似性且具有相同的保守序列。OspF蛋白家族是一类磷酸苏氨酸裂合酶,它能够通过去磷酸化MAPK激酶中的磷酸苏氨酸,抑制MAPK信号通路,从而影响细胞的生长、分化、对环境的应激适应和炎症反应等多种重要的细胞生理、病理过程。我们利用异源表达,点突变和体外生化实验研究LanKC的N-端结构域的功能和构效关系。通过LanKC-lyase与包含pSer的小肽进行反应,经过LC-MS分析,我们初步得到脱磷酸的产物。对该酶进行酶促动力学分析,结果显示LanKC-lyase的Km为50μM,Kcat为0.78/S。进一步对LanKC-lyase中7个保守氨基酸进行突变,体外反应结果显示,7个突变后的蛋白活性均有所降低,其中K94A位点突变后对酶活性的影响较为显著,R128A氨基酸突变后对酶活性影响相对较小,其余5个氨基酸位点的突变也均对coeKC-lyase的酶活性产生了一定影响。LanKC蛋白与OspF家族蛋白在功能上的重要区别在于:OspF家族蛋白识别宿主MAPK中的一种特异性磷酸化苏氨酸,而LanKC蛋白识别其前体肽中包含的所有磷酸化丝氨酸和磷酸化苏氨酸。我们的研究初步揭示了LanKClyase的催化机理,进一步结合LanKC-lyase的蛋白结构,探究其功能和构效之间的关系,可为Ⅲ类羊毛硫肽的组合生物合成提供理论基础,最终为药物筛选提供有效的前体分子。
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R91
【图文】：

图 1.1 RiPPs 的通用合成途径Figure 1.1 General synthetic route of RiPPs一般地，先由核糖体合成一段前体肽（Precursorpeptide），这段前体肽主要包括四个部分：前端的信号肽（Signal）、前导肽（Leaderpeptide）、核心肽（Corpeptide）以及识别序列（RecognitionSequence）。前导肽作为识别信号被基因簇中的其他修饰酶所识别，修饰酶对核心肽部分进行一系列的修饰，接着前导肽部分会被特定的蛋白酶水解，释放出成熟的具有生物活性的 RiPPs[16]。（2）羊毛硫肽合成机制在核糖体合成翻译后修饰多肽中，羊毛硫肽是其中重要的一类。羊毛硫肽中具有特殊的包含硫醚交联的羊毛硫氨酸（Lan）和甲基羊毛硫氨酸（MeLan）结构，其中具有抗微生物活性的羊毛硫肽被称为羊毛硫抗生素。此类多肽在生物合成过程中，前体肽中的 Ser 和 Thr 会首先发生脱水形成 Dha 和 Dhb 残基，后 Dh和 Dhb 残基和前体肽中包含的半胱氨酸残基发生米歇尔加成，分别形成 Lan 和

图 1.2 羊毛硫肽的分类Figure 1.2 Classification of lanthiopeptides（3）羊毛硫抗生素的应用前景羊毛硫抗生素是一类重要的具有抗菌活性的肽类化合物。其中，michiganinA 对一些革兰氏阳性菌具有有效的抑制作用，它能够抑制一些与其产生菌亲缘关系较近的革兰氏阳性菌；也有一些抗菌肽如 microbisporicin 可抑制诸多种类的革兰氏阳性菌，其中也包括一些在临床上具有高度耐药性的病原菌，如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和耐万古霉素的肠球菌等；Cinnamycin 可以抗一部分的革兰氏阳性菌，同时也发现其具有一定的抗真菌能力，并且对 I 型单纯性疱疹病毒的增殖也具有一定的抑制作用；作为食品保鲜剂，羊毛硫肽抗生素中最早发现也是研究最清楚的羊毛硫肽类抗生素 Nisin，现已经在工业史上存在近 50 年左右，另一种食品保鲜剂 Variacin，也被认为有着巨大的经济潜力，该类羊毛硫抗生素可抑制大多数引起食物腐败的革兰氏阳性菌，其不仅能耐高温环境，更是在

图 1.3 毒力因子注入真核细胞并操纵宿主细胞信号传导途径ure 1.3 Injecting virulence factors into eukaryotic cells and manipulating hostsignaling pathways泌装置具有一个类似针形的小分子结构，此装置可以直接将效应蛋到宿主细胞中，此过程也可以逃避宿主的识别系统[48]。进入宿主蛋白通过干扰宿主细胞的 MAPK 通路从而阻止细胞发生免疫应答的免疫抑制中起到重要的作用[49]。F 家族 家族是一类磷酸苏氨酸裂解酶，这类裂解酶包括已知的效应蛋白其可以特异的识别磷酸化的 MAPK（p-MAPK）氨基酸序列中保结构，磷酸苏氨酸裂解酶活性将 MAPK 活性所需的磷酸苏氨酸转，一种含有不饱和 Ca-Cb 双键的烯烃。磷酸基团的这种 β-消除导，这种修饰可将其称为消除化，修饰结果是产生不饱和的氨基酸（图

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本文编号：2762781