AMPA受体与Stargazin相互作用的研究以及奥拉西坦和茴拉西坦对AMPA受体通道亚型的影响

发布时间：2020-07-23 15:48

【摘要】：离子型谷氨酸受体(ionotropic glutamate receptor,iGluRs)通过偶联离子通道,使突触后神经元去极化,介导了中枢神经系统中大部分的快速兴奋性神经传递。离子型谷氨酸受体根据各个亚群的同源性和药理学特征,可以将其分为4种:N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受体、α-氨基-3-羟基-5-基-4-异恶唑(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole acid,AMPA)受体、海人藻酸(kainate acid,KA)受体和孤儿受体。所有的谷氨酸受体亚单位的拓扑学结构相同,均是从细胞膜外N端起始,依次包括氨基端结构域(ATD)、配体-受体结合结构域(LBD)、由三个跨膜结构域,一个折返环路构成的离子孔道区形成的跨膜结构域(TMD)和一个伸向胞内的尾巴C端(CTD)组成。AMPA受体是由一种或者多种亚单位[Glu(A1-4)]组成的四聚体,快速激活并快速脱敏是AMPA受体通道最重要的特征。大量研究表明,许多膜蛋白与离子型谷氨酸受体相互作用,共同调节谷氨酸受体的功能和表达,这些蛋白被命名为谷氨酸受体辅助亚单位。其中辅助亚单位TARPs(transmembrane receptor regulatory proteins)通过与AMPA受体的相互作用,参与调节AMPA受体的表达和功能。Stargazin(STZ,γ_2)蛋白是第一个被鉴定的TARPs成员,来源于基因突变小鼠,通过减弱失活和脱敏而增强AMPA受体活性,增强脱敏后的恢复,并具有调节AMPA受体药理学功能的特性。但STZ如何精确调节AMPA受体通道功能目前还不十分清楚。奥拉西坦(oxiracetam,ox)和茴拉西坦(aniracetam,ani)属于吡咯烷酮类益智药,是γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid,GABA)衍生物,在临床上广泛应用于治疗认知障碍,改善学习记忆能力。此类益智药均是基于对吡拉西坦进行结构修饰而合成的吡拉西坦衍生物,作用于AMPA受体,调节AMPA受体的功能,属于AMPA受体调节药。奥拉西坦是吡拉西坦的类似物,其药效为第一代吡咯烷酮类益智药吡拉西坦的3-5倍,茴拉西坦是吡拉西坦的N-侧链衍生物,药效也强于吡拉西坦,但奥拉西坦和茴拉西坦对于AMPA受体分子的确切药理作用机制尚不清楚。因此本研究应用分子生物学和电生理学技术,研究了Stargazin和AMPA受体相互作用的精确调控机制,以及奥拉西坦和茴拉西坦对AMPA受体不同亚型的影响。第一部分AMPA受体与Stargazin之间的静电吸引力对AMPA受体动力学参数的影响目的:通过改变AMPA受体或Stargazin某位点的氨基酸种类,改变AMPA受体和Stargazin之间的静电吸引力,以此探究AMPA受体和Stargazin之间的静电吸引力对AMPA受体功能的影响。方法:将分子生物学技术和电生理学技术相结合,利用基因点突变和膜片钳外面向外细胞记录方法,来探究AMPA受体和Stargazin之间的静电吸引力对AMPA受体通道亚型GluA2通道动力学参数的影响。结果:1.10 mM谷氨酸作为激动剂,记录AMPA受体通道亚型GluA2通道及共表达STZ电流的变化。对照组共转Glu A2+STZ时,AMPA受体通道亚型GluA2通道的激活时间常数τ为0.26±0.09(ms);当进行氨基酸点突变,无论全部或部分减弱STZ和AMPA受体之间的相互作用时,共转GluA2+STZ突变体的激活时间常数均明显延长,如共转Glu A2+STZ-4A通道的激活时间常数τ为1.87±0.59(ms),明显长于STZ野生型共转(P0.0001)。2.减弱STZ和AMPA受体间的相互作用对受体的去活过程影响不大,只有全部打破STZ和AMPA受体的相互间作用才能影响通道的去活过程。3.通过部分和全部将STZ和AMPA受体的相互作用交界面上的氨基酸电荷极性突变,我们发现交界面的氨基酸电荷相互排斥时,明显改变AMPA受体的激活、脱敏和去活过程过程。4.通过氨基酸点突变,我们找到了决定STZ影响AMPA受体的脱敏的关键氨基酸位点(STZ-E90)。小结:AMPA受体和Stargazin之间静电吸引力促进了AMPA受体的激活、脱敏、脱敏的平台期电流和峰值电流的比值,对去活过程影响不明显。第二部分奥拉西坦对AMPA受体通道亚型GluA2和GluA4通道的影响目的:研究奥拉西坦对AMPA受体通道亚型GluA2和GluA4通道的作用,在分子水平进一步深入研究奥拉西坦益智作用的分子机理。方法:利用膜片钳外面向外细胞记录和给药方法来确定奥拉西坦对AMPA受体通道亚型GluA2和GluA4通道的作用。结果:奥拉西坦可以明显抑制AMPA受体通道亚型GluA2和GluA4通道的峰值电流和脱敏的平台期电流。1.5 mM奥拉西坦可以使AMPA受体通道亚型Glu A2通道峰值电流与平台期电流均减小,峰值电流减小至对照组电流的71.28±0.09(%),平台期电流减小至对照组电流的61.46±0.05(%)。而对AMPA受体通道亚型GluA2通道的脱敏、去活及脱敏后再恢复动力学特征均无显著影响。2.5 mM奥拉西坦也可以使AMPA受体通道亚型Glu A4通道峰值电流与平台期电流均减小,峰值电流减小至对照组电流的71.23±0.04(%),平台期电流减小至对照组电流的67.16±0.05(%)。对AMPA受体通道亚型GluA4通道的脱敏、去活及脱敏后再恢复动力学特征均无显著影响。小结:奥拉西坦通过与AMPA受体通道亚型Glu A2通道和GluA4通道结合,仅仅抑制了AMPA受体通道亚型Glu A2通道和GluA4通道的激活,而不影响AMPA受体通道亚型GluA4通道开放后的功能状态改变。第三部分茴拉西坦对AMPA受体通道亚型GluA2和GluA4通道的影响目的:研究茴拉西坦对AMPA受体通道亚型GluA2和GluA4通道的作用,在分子水平进一步深入研究奥拉西坦益智作用的分子机理。方法:利用膜片钳外面向外细胞记录和给药方法来确定茴拉西坦对AMPA受体通道亚型GluA2和GluA4通道的作用。结果:1.5 mM茴拉西坦不影响AMPA受体通道亚型GluA2和GluA4通道峰值电流与平台期电流。2.茴拉西坦可以显著减慢通道亚型GluA2通道电流的脱敏过程,明显延长脱敏时间(P0.0001)。并且茴拉西坦应用后,AMPA受体通道的去活过程也显著延长(P0.05),但对AMPA受体通道亚型Glu A2通道脱敏再恢复过程没有影响(P0.05)。3.茴拉西坦也可以显著减慢通道亚型GluA4通道电流的脱敏过程,明显延长脱敏时间(P0.001)。并延长GluA4通道的去活过程(P0.05),但对AMPA受体通道亚型GluA4通道脱敏再恢复过程没有影响。小结:茴拉西坦通过与AMPA受体通道亚型GluA2通道和GluA4通道结合,减慢了AMPA受体通道亚型GluA2通道和GluA4通道的关闭和脱敏过程,不影响AMPA受体通道亚型GluA2通道和GluA4通道的脱敏后再恢复过程、通道的电流和脱敏的平台期电流。结论:1.AMPA受体和Stargazin之间的静电吸引力决定了AMPA受体通道亚型GluA2通道的激活和脱敏。2.益智药奥拉西坦和茴拉西坦尽管都是吡拉西坦的类似物,但其对AMPA受体的调节机制存在明显差异。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R96
【图文】：

统计图,亚型,野生型,突变体

图 6 野生型和突变体 AMPA 受体通道亚型 GluA2 通道去活电流图(A)和去活时间常数统计图(B)（***P<0.001）Fig.6 Deactivation currents (A) and the time constants of the deactivation(B) of GluA2 channels in wild type and mutants. ***P<0.001 vs control.

统计图,亚型,野生型,突变体

图 7 野生型和突变体 AMPA 受体通道亚型 GluA2 通道脱敏电流图(A)和脱敏时间常数统计图(B)（***P<0.001, ****P<0.0001）Fig.7 Desensitization currents (A) and the time constants of the desensitization(B) of GluA2 channels in wild type and mutants. ***P<0.001,****P<0.0001vs control.

统计图,亚型,统计图,AMPA受体

拉西坦组 AMPA 受体通道亚型 GluA4 通程统计图（P>0.05）onstants of the recovery of GluA4 channelsGlu and 5 mM oxiracetam. P>0.05 vs contro

【参考文献】