毛细管电泳法评价血小板、凝血酶与小分子化合物的相互作用

发布时间：2020-07-23 10:05

【摘要】：生物大分子与生物大分子或小分子的相互作用广泛存在于生物体的许多生理过程中,如基因转录、信号传导、酶催化过程等。受体理论认为,药物产生药效的前提之一是药物分子与受体产生特异性结合。因此,评价生物大分子与生物大分子或小分子的相互作用具有重要的意义。目前,毛细管电泳(Capillary electrophoresis,CE)已广泛应用于核酸、蛋白质、细胞膜、细菌或细胞与小分子的相互作用研究。血小板膜受体和凝血酶作为抗血栓形成治疗中最主要的药物作用靶标已被用于抗血栓形成活性成分的评价或筛选。本文分别采用前沿分析毛细管电泳法(Frontal analysis capillary electrophoresis,FACE)及亲和毛细管电泳法(Affinity capillary electrophoresis,ACE)评价了血小板与小分子,凝血酶与小分子的相互作用;并建立了基于毛细管电泳的在线固定化凝血酶微反应器用于凝血酶抑制剂的筛选。本论文主要包括以下五个部分:第一部分为绪论部分,简述了血小板、凝血酶在血栓形成过程中的重要作用;以血小板、凝血酶为受体靶的抗血栓形成活性成分的筛选及评价研究进展;CE在核酸、蛋白质、细胞膜、细菌及细胞与小分子相互作用评价中的应用;以及基于CE的酶微反应器的研究进展。第二部分基于聚乙烯醇(Polyvinyl alcohol,PVA)动态毛细管涂层,应用FACE法分别测定了血小板与8个生物碱小分子化合物(海罂粟碱、木兰花碱、脱氢紫堇碱、小檗碱、巴马汀、异钩藤碱、钩藤碱和马钱子碱)的位点结合常数及化学计量数。结果显示海罂粟碱、脱氢紫堇碱及异钩藤碱与血小板具有较强的相互作用。第三部分采用ACE法测定了凝血酶与10个酚类化合物(对羟基苯甲酸、原儿茶酸、香草酸、没食子酸、儿茶素、表儿茶素、二氢槲皮素、柚皮素、芹菜素和黄芩素)的结合常数,在结合常数计算过程中,引入了“淌度比”的概念以消除缓冲液粘度变化对结合常数测定的影响。同时,通过分子对接技术获得了6个黄酮化合物(儿茶素、表儿茶素、二氢槲皮素、柚皮素、芹菜素和黄芩素)与凝血酶活性中心结合的最佳构象及作用氨基酸残基。ACE结果显示没食子酸及6个黄酮化合物与凝血酶具有较强的相互作用。分子对接结果显示6个黄酮化合物与凝血酶对接的最佳构象均位于凝血酶活性中心并与催化三元组中的SER195或HIS57存在作用。第四部分建立了基于毛细管电泳的在线凝血酶固定化酶微反应器(Immobilized enzyme microreaction,IMER)并应用于表儿茶素(Epicatechin,EC)、表没食子酸儿茶素(Epigallocatechin,EGC)、表儿茶素没食子酸酯(Epicatechin gallate,ECG)、表没食子酸儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin gallate,EGCG)的抗凝血酶活性评价。同时,通过分子对接技术从分子水平上分析了儿茶素抑制凝血酶的作用机制。实验结果显示毛细管电泳凝血酶IMER已成功建立,并可用于凝血酶抑制剂的筛选。凝血酶抑制试验结果显示ECG和EGCG具有显著凝血酶抑制作用,进一步分子对接结果显示ECG和EGCG结构中的苯并吡喃环插入了凝血酶的催化活性口袋,并与LYS60F、TRP60D、TRY60A、IEU99、GLY216、HIS57和SER195等产生相互作用。第五部分为实验总结及展望。基于CE在生物样品分离、分析中所具有的独特优势,CE技术将在细胞、蛋白质与小分子的相互作用研究中发挥重要作用,而结合分子对接技术可为小分子的作用机制研究及药物筛选提供重要的参考依据。此外,基于CE的在线IMER具有酶量消耗少、稳定性好等优点也可直接用于酶抑制剂的筛选。
【学位授予单位】：重庆大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R914
【图文】：

示意图,血小板活化,示意图,纤维蛋白原

重庆大学硕士学位论文PⅡb/Ⅲa 抑制剂。其中，ADP 受体拮抗剂如氯吡格雷、普拉格剂 ADP 与受体 P2Y12的结合从而抑制血小板活化；纤维蛋白原单抗、替罗非班是通过抑制活化的 GPⅡb/Ⅲa 与纤维蛋白原结的聚集。这三类抗血小板聚集药物显著降低了心血管疾病的发们仍存在一定的不良反应，如胃肠道反应、血小板减少、出血新的抗血小板聚集药物仍具有一定的必要性。

凝血,级联反应,外源性,内源性

图 1.2 凝血级联反应中的外源性、内源性、共同凝血途ure 1.2 Extrinsic, intrinsic and common pathways of coagulatio具有自我放大和自我制约两方面的特性，表现为凝反馈激活凝血因子Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅹ、Ⅺ和凝血酶原有利于在需要形成止血栓的部位迅速发生血液的凝能破坏因子Ⅷa 和Ⅴa，故亦有防止不适当过度凝血是通过抑制凝血酶活性或者减少凝血酶的生成以达用的抗凝血药物主要包括：传统抗凝药如肝素（普素 K 抑制剂（华法林）及新型抗凝药如直接凝血酶见表 1.1）[19]。传统抗凝药物在临床应用中需要密并存在严重出血等副作用，而新型抗凝药仅对单个与食物或药物的交叉反应、使得其生物利用度提高低[20]。表 1.1 凝血酶及凝血因子Ⅹa 抑制剂

结合常数,毛细管电泳,药物

图 1.3 毛细管电泳中常用的结合常数测定方法比较Figure 1.3 The common methods for determination of binding constants in capillaryelectrophoresis① FACE 法在 FACE 法中，毛细管预先充满电泳缓冲液，然后将药物与蛋白质的平衡液大体积进样，在电场驱动下，样品组分的区带则由最初的叠加状态向分离状态过渡，最终形成连续或独立的平台峰。平台峰的高度不受毛细管长度、应用电压、迁移时间及电渗流的影响，因此，在实验过程中应尽量保证平台峰的形成。游离药物的平台峰高度与其浓度呈线性关系，由此可以计算出游离药物的浓度，然后计算得到结合常数及化学计量数。FACE 法适用于强结合、慢动力学体系，在研究蛋白质与药物相互作用时需要满足以下两个条件：一是药物与药物-蛋白质复合物具有不同的迁移速率；二是蛋白质与药物-蛋白质复合物具有相同的迁移速率。② ACE 法

【参考文献】